Compound 48/80对apoE基因敲除 小鼠颈总动脉套环诱导斑块的影响
南华大学心血管病研究所
唐 雅 玲
肥大细胞与动脉粥样硬化
肥大细胞(mast cell,MC)来源于骨髓多能干细胞,主要位于结缔组织内,其主要特征为胞浆内含有大量异染性颗粒,颗粒中含有多种生物活性成分。
近年来对动脉粥样硬化斑块切除标本及尸检标本的研究表明，肥大细胞对动脉粥样硬化斑块的形成和发展起着重要作用。
本研究所已在细胞学水平，多方面探讨了肥大细胞促进动脉粥样硬化发生发展的机制，得到的主要结论有：
肥大细胞促进氧化低密度脂蛋白诱导的平滑肌细胞泡沫化；
肥大细胞抑制巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇流出。
到目前为止，有关肥大细胞与动脉粥样硬化关系的研究主要是病理学观察和细胞学实验。
本课题采用动物在体实验，将Compound 48/80作用于颈总动脉套环的apoE-/-小鼠，探讨肥大细胞脱颗粒对斑块特性（包括大小、细胞成分、血管新生和出血）的影响及其可能机制。
实 验 方 法
动物饲养
40只10周龄雄性apoE-/-小鼠，高脂高胆固醇饲料 （0.25％胆固醇＋15％猪油）饲养于SPF房中。
右颈总动脉套环术
实验分组
术后4周 随机分为两组，每组20只：
实验组 腹腔注射Compound 48/80 （0.5mg/kg）
对照组 腹腔注射相同体积的D-Hank，s
隔日一次，共4次，第4次注射后半小时，采血、安乐死处死小鼠。
原位灌流固定、取材
全自动生化分析仪测定血清中脂质含量
比色法测定血清中类胰蛋白酶活性
石蜡切片制作
苏木素－伊红染色
甲苯胺蓝染色
vWF、α-smooth muscle actin、Mac3、IL-1β免疫组织化学染色
bFGF mRNA原位杂交及免疫荧光检测
图像分析 、统计学分析
实 验 结 果
Compound 48/80对血脂含量无明显影响
表1 血清脂质含量（mmol/L ）
组 别 TG TC HDL-C LDL-C
?
对照组 1.30±0.37 12.74±0.93 0.46±0.12 12.02±0.91
实验组 0.94±0.22 11.74±3.56 0.53±0.06 11.01±4.13
实验组与对照组相比，P＞0.05
Compound 48/80升高血清类胰蛋白酶活性
表2 血清类胰蛋白酶活性（u/L）
组 别 类胰蛋白酶活性
对照组 0.36±0.10
实验组 0.57±0.13*
*与对照组相比，P＜0.05
Compound 48/80刺激颈总动脉外膜肥大细胞脱颗粒
对照组
实验组
甲苯胺蓝染色（10×100）
*与对照组相比，P＜0.05
图1 Compound 48/80对套环侧颈总动脉外膜肥大细胞脱颗粒的影响
?
B
A
套环加速颈总动脉斑块形成、Compound 48/80增大套环侧颈总动脉斑块面积，并使套环侧颈总动脉狭窄程度加重
对照组未套环侧
实验组未套环侧
对照组套环侧
实验组套环侧
颈总动脉石蜡切片HE染色（10×20）
*与同组未套环侧相比，P＜0.05, ﹟与对照组相比，P＜0.05
*与对照组相比，P＜0.05
图2 套环及Compound 48/80对颈总动脉斑块面积及狭窄程度的影响
A
D
C
B
A
B
Compound 48/80使斑块内平滑肌细胞数量增加
对照组
实验组
α- smooth muscle actin免疫组化（10×20）
*与对照组相比，P＜0.05
图3 Compound 48/80对套环侧颈总动脉斑块内平滑肌细胞的影响
B
A
Compound 48/80使斑块内巨噬细胞数量增加
对照组
实验组
Mac3免疫组化（10×20）
*与对照组相比，P＜0.05
图4 Compound 48/80对套环侧颈总动脉斑块内巨噬细胞的影响
B
A
B
Compound 48/80促进斑块内IL-1β的表达
*与对照组相比，P＜0.05
图5 Compound 48/80对套环侧颈总动脉斑块内IL-1β表达的影响
?
IL-1β免疫组化（10×20）
实验组
对照组
B
A
B
Compound 48/80促进 斑块内血管新生
对照组
实验组
vWF免疫组化（10×20）
*与对照组相比，P<0.05
Compound 48/80对套环侧颈总 动脉斑块内血管新生的影响
A
B
图6
Compound 48/80促进斑块内bFGF mRNA的表达
对照组
实验组
bFGF mRNA原位杂交（10×20）
*与对照组相比，P<0.05
Compound 48/80对套环侧颈总动脉 斑块内bFGF mRNA表达的影响
?
A
B
图8
Compound 48/80促进斑块内bFGF的表达
对照组
实验组
bFGF免疫荧光（10 ×20）
*与对照组相比，P<0.05
Compound 48/80对套环侧颈总动脉 斑块内bFGF表达的影响
A
B
图9
Compound 48/80促进斑块内出血
套环侧颈总动脉HE染色 （10×40）
*与对照组相比，P<0.05
图10 Compound 48/80对套环侧颈总动脉斑块内出血的影响
?
?
A
B
对照组
实验组
讨 论
本课题选用颈总动脉套环的apoE基因敲除小鼠作为动物模型。
apoE基因敲除小鼠是动脉粥样硬化易感动物，在高脂高胆固醇饲料喂养下出现了高脂高胆固醇血症，同时通过颈总动脉套环造成管腔狭窄，从而促使套环侧颈总动脉斑块快速形成。
本课题将Compound 48/80作用于上述动物模型，结果表明Compound 48/80能增加套环侧颈总动脉斑块最大横截面积、颈总动脉最大狭窄程度，增加斑块内平滑肌细胞和巨噬细胞的数量，促进斑块内IL-1β的表达、斑块内血管新生和斑块内出血。
结 论
套环能加速apoE基因敲除小鼠颈总动脉斑块形成。
Compound 48/80使颈总动脉斑块最大横截面积、颈总动脉最大狭窄程度增加，其机制可能与其刺激肥大细胞脱颗粒促使平滑肌细胞增殖、巨噬细胞聚集有关。
Compound 48/80促进斑块内IL-1β的表达。
Compound 48/80促进斑块内血管新生，其机制可能与其增加斑块内bFGF mRNA和蛋白的表达有关。
Compound 48/80促进斑块内出血。