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The Ophthalmology Center，Tianjin Medical University，Tianjin300070
【Abstract】 Objective To observe the morphology changes induced by myopic LASIK vary length of follow-up.Methods This study comprised34patients（68eyes）who had undertook LASIK in ophthalmology center of Tianjin medical university from1999Apr.17to2002Jul.31（range from6to44months）were examined after operation using an in vivo confocal microscopy.The average spherical equivalent was-6.81±2.88D（range from-3.0to-16D）.The average age was（24.17±5.93）years old（range from18to42years old）.The average follow-up time was（16±9.5）months（range from6to44months）.Results The Microfolds at the Bowman's layer were found in68eyes（100%），as well as variously reflectivity particles located at the interface level in all eyes examined after operation.The density of high reflective particles had not decreased significantly with time.In the middle stroma，the mean depth of acellular area was（44.01±10.67）μm in all68eyes（100%）.Conclusion Morphologic changes have showed in central cornea.A-cellular area，microfolds and as well as variously reflectivity particles located at the interface level in all eyes have existed in the central cornea for long time.
Key words LASIK long-time the morphology of cornea confocal microscopy
共聚焦显微镜是一种高清晰度、高放大倍率、三维、实时对角膜光学断层扫描技术，可以从活体上在细胞水平观察到角膜组织生理病理动态变化，本文通过对LASIK术后远期角膜基质形态学改变的共聚焦显微镜观察，以探求术后远期角膜屈光状态的改变在组织学上的影响因素，客观评价术后长期角膜的状况，从而为进一步改善屈光手术提供客观依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选择1999年4月17日～2002年7月31日期间在天津医科大学眼科中心屈光手术门诊行LASIK手术的患者68例（68眼），其中男39例（39眼），女29例（29眼）;术前平均球镜-6.81±2.88D（-3.0～16D），平均年龄24.17±5.93岁（18～42岁）;术后平均随访时间为16±9.5个月（6～44个月）。纳入条件:（1）LASIK术后未因屈光回退进行第2次手术;（2）术前未戴过硬性或软性接触镜;（3）术后无其他眼内疾患，无眼外伤史，无眼内手术史;（4）术后至随访时无因全身性疾病而接受过影响角膜代谢的药物治疗如乙胺碘呋酮、异维甲酸等;（5）术后未因使用激素导致眼内压升高病史。
1.2 手术方式 手术术式为角膜原位磨镶术（Laser in situ keratomileusis，LASIK）。采用手动SCMD角膜板层刀;193mm激光机为VISX（VISX，Santa，20/20 R ）第二代产品。
1.3 检查方法 采用半自动扫描方式对所有病例中央区角膜进行共聚焦显微镜（Confoscan3.0）检查。（1）仪器:共焦显微镜（Confoscan3.0，Model P3，Fort-ane technologie Sal Italy）由日本NIDEK公司提供，其主要装置是12V/100W的卤素光源和IR（红外线）、UP（紫外线）滤过器;40×/0.75W∞/0水浸式物镜;CCD照相机;高速数码录图像机;PC计算机;LCDS-VGA15″显示器;NAVIS软件系统。（2）主要技术参数:放大倍数为1000×;水浸式物镜的视野为330mm×400mm;景深10μm，侧像分辨率是1～2μm，物镜与角膜的距离为2mm;扫描频率为20Hz;每次扫描350幅图。完成1次扫描需7s。每幅图像大约可见475mm×350mm角膜组织，扫描厚度为8μm，背景相对暗度为10DB，并确保物镜有恒定的扫描速度。本研究采用半自动扫描。（3）检查步骤:①令患者坐于检查台前，将检查的注意事项详细告之患者，减轻患者的紧张心理。②将患者的下颌及前额固定在显微镜的检查托架上，用0.4%努氟卡因滴眼液做表面麻醉，置开睑器。③在40倍水浸式圆锥状物镜表面涂上凝胶，将镜头缓慢前移，使凝胶与角膜中央接触，镜头与角膜之间的距离为2mm，当看到角膜内皮清晰地居于显示器视屏中央时按下摄录按钮，角膜各层的图像即可被s-VHS数码摄像机记录，通过显示器筛选需要的图像存盘。（4）数据获得的方法:选择无眼球侧向运动和前后运动，上皮波、内皮波、神经纤维丛波、内皮波完整Z-scan的图像用于资料分析。在特定区域中可见到数量不一、反光强弱不一的颗粒，此处被认作“界面”。
测量结果均以3次测量的平均值作为统计数据。
1.4 统计学方法 应用SPSS10.0统计软件进行数据分析。
2 结果
2.1 中央角膜基质形态学改变 68眼（100%）中央角膜可以见到微皱折。微皱折的形状呈网格状、分支状，可浅及前弹力层，亦可深及前基质层（见图1，图2）。
在基质特定深度有一些粉尘样碎屑和高反光颗粒，数目、大小不一，约有17眼（26.4%）有高反光颗粒，颗粒形状多呈三角形。有61眼（89.7%）有与基质角膜细胞反射亮度相同的粉尘样碎屑;仅有少量（10.29%）的中央角膜无特殊颗粒存在（见图3，图4，图5）。
2.2 中央角膜基质无细胞区长期存在 在特定区域中可见到数量不一、反光强弱不一的颗粒，此处被认作“界面”。在该界面上下，68眼（100%）中央角膜见到深度为44.01±10.67μm的低细胞区域。低细胞区内的角膜细胞形态与正常有异，细胞核排列无序，反射亮度正常（见图6）。基质角膜细胞数目明显减少（562±86，419～818个/mm 2 ），与正常对照该基质深度角膜细胞密度差异有显著性（t=-4.077，P=0.000）（见表1）。在低、中度近视眼与高度近视眼的界面角膜细胞数、低细胞区域深度差异无显著性。
表1 屈光度小于-6.0D与大于-6.0D界面角膜细胞、低细胞区深度比较 （略）
2.3 角膜瓣与角膜基质非瘢痕性愈合
图1 LASIK术后32个月，位于前基质层中微皱褶，呈分支状 略
图2 LASIK术后44个月，位于前弹力层中微皱褶，呈网状略
图3 LASIK术后38个月，位于“界面”下的片状无细胞区长期存在 略
图4 LASIK术后40个月，位于“界面”的异常颗粒 略
图5 LASIK术后6个月，位于“界面”的异常高反光颗粒，可疑为金属异物 略
图6 LASIK术后39个月，位于“界面”的异常低反光颗粒，呈粉尘样，来源不详 略
3 讨论
普遍认为LASIK术式保持了前部组织（上皮、Bowman膜、前基质角膜细胞层）的完整性，更符合角膜的解剖生理要求，因而减轻了角膜愈合反应，具有较为广阔的发展前景。但该术式毕竟对角膜组织产生一定的创伤性，组织对创伤的修复是影响手术效果的一个重要因素。共聚焦显微镜是一种高清晰度、高放大倍率、三维、实时对角膜光学断层扫描技术，本研究应用它的可重复性和可靠性，从活体上在细胞水平观察到角膜术后远期生理病理变化，测量到角膜厚度的改变，探求术后远期角膜屈光状态的改变在组织学上的影响因素，客观评价术后长期角膜的状况，从而为进一步改善屈光手术提供客观依据。
角膜瓣与基质之间的贴附是非瘢痕性。在基质特定深度有一些粉尘样碎屑和高反光颗粒。数目、大小不一，通过这些颗粒笔者来确定手术界面的位置。“界面”是角膜瓣与角膜基质相贴合的位置，该处基质无异常纤维束交错，且在“界面”上下基质中大约有44.01±10.67μm区域角膜细胞密度明显下降，出现大片“无细胞区”，界面角膜细胞数与正常50%～60%深度基质角膜细胞密度相比差异有显著性（t=-10.517，P=0.000）。相同层面的基质细胞形态呈椭圆或多角形，反射强度正常，未见到高反光、长梭形细胞形态，细胞周围无异常分泌的细胞外基质。基质细胞间质清晰，背景明暗度正常。LASIK术后角膜无细胞区的出现在动物和人眼角膜中均得到证实 ［1，2］ 。角膜细胞的死亡可能与光能击射所继发光辐射作用及组织羟氢氧自由基的形成有关 ［3］ 。无细胞区的出现证实了角膜受损伤后基质角膜细胞存在“凋亡”。普遍认为LASIK、PRK术后基质角膜细胞的死亡是由导致凋亡的细胞因子所诱导的，是角膜愈合的起始因素。在高度调控的创伤修复过程中凋亡引发角膜细胞的激活、增殖、分化、细胞因子的释放，细胞外基质的合成与重构等，众多细胞因子和多种细胞在时间和空间上高度协调而完成对创伤的修复。在随访的病例中，术后44个月的角膜中央仍可见深度约48.8μm的无细胞区域存在。无细胞区长期存在的生理或病理意义不详。但这一现象至少表明基质损伤后基质角膜细胞的丢失不能用基质角膜细胞的分化、增殖、迁移来再充填。这与穿透性角膜移植术后基质细胞密度减少结果相一致 ［4］ 。68眼（100%）中央角膜可以见到微皱折。微皱折长期存在，其形状呈网格状、分支状，可浅及前弹力层，亦可深及前基质层。对微皱折的形成说法不一，网格状微皱折位置一般深及角膜基质层，形成平行的不同反射亮度的皱折，止于界面水平，与角膜瓣基质的皱缩有关 ［5］ 。若微皱折呈不平行网格状，皱折较乱，与手术角膜瓣复位对位不良有关。细而分叉的皱折与角膜瓣失水变薄、角膜瓣基质胶原层张力下降有关。再次手术不能改善角膜微皱折的状况，反复的起瓣反而增加角膜不规则散光。本次研究没有发现微皱折随时间的变化减少的趋势，因而，角膜平均曲率和角膜柱镜屈光度较为稳定。
在基质特定深度有一些粉尘样碎屑和高反光颗粒。数目、大小不一，通过这些颗粒来确定手术界面的位置。“界面”是角膜瓣与角膜基质相粘合的位置。在此处，约有24眼（35.29%）有高反光颗粒，颗粒形状多呈三角形。有67眼（98.52%）有与基质角膜细胞反射亮度相同的粉尘样碎屑;仅有1眼（1.47%）的中央角膜无特殊颗粒存在。共聚焦显微镜下异常颗粒的周围无炎性细胞浸润，高反光颗粒似镶嵌在基质组织中，颗粒数量与时间无关系，不能通过颗粒的多少来判定手术的时间，这些颗粒的性质及来源不明，可能是角膜刀带进来的上皮细胞碎屑、睑板腺中的蜡样油脂、甲基纤维素吸水海绵、手 术无菌手套中的滑石粉、角膜基质细胞的碎屑 ［6，7］ 等，改善手术技术可明显减少基质中的颗粒。随访期间，没发现异常颗粒的存在对角膜组织产生不良影响，对组织的长期影响不明。
综上所述，基质形态学发生改变，术后角膜低细胞区域、微皱折、异常颗粒长期存在。角膜瓣与角膜基质床的贴附是非瘢痕性的，故角膜保持透明，但界面处的低细胞区域长期存在，说明该处是角膜抵抗外力的薄弱环节。
参考文献
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作者单位:300070天津医科大学眼科中心