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Harvesting photoreceptor cell sheets by using excimer laser with 80 micron depth of ablation
Li Genlin,Wang Gang,Wang Jin’jin,et al.
Ophthalmologic Center,Beijing Tongren Hospital Affiliated to Capital University of Medical Sicence,Beijing 100730.
【Abstract】ObjectiveTo study the ideal ablation depth for harvesting sheets of photoreceptor cells from retina by using the excimer laser with PTK (phototherapeutic keratectomy,PTK) mode.MethodsRetinas from neonatal calf,and gelatin as carrier were used.The retinas were located firstly and then laid on the surface of gelatin carrier using the devised liquid-phase method.The PTK mode of excimer laser was used to ablate retinal sheet.Total 48 photoreceptor sheets were ablated with three depths and were studied by light and scanning electron microscope.ResultsWith 80 micron depth of ablation,photoreceptor cells were harvested as intact sheets from the retinas using the excimer laser.Light and scanning electron microscope demonstrated the sheets of photoreceptor cells with intact outer and inner segments,outer nuclear layer,outer plexform layer and some remained inner nuclear layers.However,50μm and 100μm were found to be either rather superficial or deeper than that of 80μm.ConclusionFor harvesting ideal intact photoreceptor cell sheets,80 micron would be the most suitable depth of ablation by using the PTK mode of excimer laser.
Key wordsretinaexcimer laserPTK modephotoreceptor sheets80 micron ablation
制备理想的感光细胞片层是获得视网膜移植良好手术效果的前提之一。目前制备感光细胞片层的方法有多种，包括准分子激光切削法［1，2］、振荡切削机切片法［3］等。其中准分子激光切削法因其操作简单，易于重复等特点成为目前视网膜移植研究中最常用的感光细胞片层制备手段。但在不同切削方式下，准分子激光切削视网膜制备理想感光细胞片层的要求不同，所选定的切削深度也就不同。本研究旨在探讨在PTK(phototherapeutic keratectomy)切削方式下准分子激光切削视网膜制备完整感光细胞片层所确定的最佳切削深度，以指导视网膜移植研究。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1眼球来源实验选用出生时即处死的新生小牛，均源于北京市红星屠宰场。所取眼球于冷生理盐水中，4℃下保存，4h内完成眼球处理。本实验共用眼球6个。
1.1.220%白明胶载体制备量取50ml林格液于三角烧瓶中，加热到80℃时，将称量好的白明胶10g倒入。搅拌使明胶充分溶解，避免出现不溶解的白明胶块。将其移至42℃水浴中保存备用，静置20min。然后将白明胶液移置一培养皿中，在22℃下保存。待制作超薄载体用。
1.1.3超薄白明胶载体制备取已配制好的20%白明胶，用特制载玻片一张，根据公式S·H=V［S：铺片的表面积(mm2)，H：欲制载体厚度(mm)，V：白明胶使用量(ml)］，制备厚度为40μm的超薄白明胶载体数张，-20℃下凝固后，制备成5mm×5mm×0.4mm大小的载体待用。
1.2方法
1.2.1视网膜预定位和液相铺片法［4］：（1）分离眼杯：将所取眼球置于一自制的眼球切割平台上，从眼球角膜缘后2mm处环形切开眼球，先分离开前、后眼杯。将带有玻璃体的后眼杯转移到一普通培养皿中，用镊子轻轻将玻璃体与视网膜分离开后，露出视网膜，使眼杯口朝上，将眼杯内加入少量液体。（2）视网膜定位和取材：用一特制视网膜定位器从视神经乳头始放射状向周边行视网膜定位，然后用直径为6mm的视网膜环钻器依次在每个视网膜上取8个圆形视网膜。用自制的视网膜转移托并配合虹膜恢复器将取好的视网膜转移到一预置的培养皿内。（3）液相视网膜铺片：取直径为20cm，深度为15cm，内含MEM的培养皿，收集已预定位取材的视网膜切片。取上述带有超薄白明胶载体的盖玻片，将其放置于一特制的塑料漏斗中，借助液体的流体力学原理，在液体中将每个盖玻片上平整铺上2块视网膜片。然后，将带有视网膜的盖玻片平移至普通培养皿中，在每个盖玻片的周围滴放适量的培养液，密封四周制成湿房，待激光切削用。
1.2.2准分子激光PTK切削参数能量密度：233mJ/cm2，切削直径：7mm，切削深度：50μm、80μm、100μm，氮流量：8个单位，切削频率：13Hz，激光腔气压：3200mbar，切削深度：10μm/50个脉冲，每脉冲切削深度：0.219μm，氟气：70%，切削脉冲数：250个脉冲，脉冲发生器：PTK切削仪器，机器测试参数：0.217，激光：He-Ne激光，机器型号：SCHWIND Keratom-F。
1.2.3准分子激光PTK切削方法通过手术显微镜在目视下，以整个视网膜为切削对象，范围覆盖整个视网膜，先调节好焦距，对好焦点后，启动切削开关，一次性完成预定切削深度。在切削前均保持被切削片表面覆盖一层液体。如此进行，三组切削深度均切削16块视网膜，共计切削视网膜块48个。
1.2.4感光细胞片层的光镜和扫描电镜分析将每个切削组的16个感光细胞片层均分成两组(每组8块)分别行H-E染色联合光镜检查，以及扫描电镜分析。
2结果
按照所设计的切削参数，分别对三组视网膜块进行50μm、80μm及100μm深度切削，每组均切削16块视网膜。比较三种切削深度条件下所得感光细胞片层结构，结果发现80μm深度切削所获得的感光细胞片层最为理想。
2.1不同深度切削制备的感光细胞片层结构特点
2.1.1对照组视网膜组织结构特点本研究以同期新出生的小牛视网膜为正常对照组（见图1）。从图1可见，此期神经视网膜各层结构已经形成，但外网状层(OPL)和内网状层(IPL)较厚。感光细胞节段虽已经形成但较短小，外核层(ONL)和内核层(INL)胞核层数较多。
2.1.250μm深度切削制备的感光细胞片层结构特点按50μm深度切削制备成的感光细胞片层残留内核层较厚（见图2）。从图2中可见，感光细胞节段层已形成但同样较短，ONL层胞核数较多，OPL较厚和疏松。从感光细胞片层内侧面可见残存的内颗粒层，胞核层厚达4～5层，片层最内侧为激光切削面。
2.1.380μm深度切削制备的感光细胞片层结构特点按80μm深度切削所得的感光细胞片层残存的内核层数则较少（见图3）。从图3可见，除与上述具有相似结构特征的感光细胞节段层、ONL、OPL之外，在片层的内侧可见残留的内颗粒层，仅含有1～2层的胞核，在片层内侧为较致密的激光切削面。
2.1.4100μm深度切削制备的感光细胞片层结构特点按100μm深度切削所得的感光细胞片层则显示切削深度过深（见图4）。从图4中可见，除残存的感光细胞节段和部分ONL外，另一部分ONL已被激光切削掉，可见ONL内清晰的致密激光切削面，更未见OPL和INL等视网膜内层结构。
2.280μm深度制备感光细胞片层的超微形态学特点光镜所见，80μm深度切削所得感光细胞片层可使内核层残留较少，且其他外层结构能均存在。TEM观察发现：在OPL内面存留的INL多为1～2层胞核，其内侧面是较致密和清晰的激光切削面。此期感光细胞节段虽有，但体小而短，头端膨大，外形呈“蘑菇状”；ONL内胞核大小较均匀，结构较为致密，可见平均7～8层核层结构；OPL清晰且可见较厚的“膜样结构”（见图5）。
3讨论
准分子激光作为一种感光细胞片层制备手段正日益受到研究者的青睐，较其他几种所用方法，此技术具有独特优点。
3.1准分子激光PTK切削方式具有的优点研究发现［1，2］，准分子激光和振荡切片法均能制备较好的视网膜感光细胞片层，其中感光细胞节段层，外核层和外网状层。Tezel等［1］发现用准分子激光制备的感光细胞片层内感光细胞活性＞94.7%，4℃下保存72h后活性仍可达86.5%。但振荡切片法制备时容易导致感光细胞外节段受损，片层易碎，费时，因而效率低下，往往一个供体视网膜只能制备1～2个感光细胞片层植片，而准分子激光切削法则避免了上述不足。
本研究从6个视网膜中各制备8个植片，共计48个视网膜片均能在短时间内切削完毕。形态学检查见所有植片均具备良好一致的组织结构，证明准分子激光PTK切削方式制备感光细胞片层技术的可行性。
3.280μm切削深度的可行性不同种系视网膜厚度基本一致［5］，但视网膜不同部位的厚度有明显差异。Huang等［2］发现：后极区上部的视网膜最厚，从感光细胞外节段到外网状层的厚度约为115～123μm，全视网膜厚度为225～230μm，周边视网膜的厚度约为后极部的60%，新鲜视网膜的厚度较固定后的视网膜厚7.9%。本系列研究曾报道不同切削深度条件下用准分子激光制备感光细胞片层的技术探讨［6］，发现80μm深度较50μm和75μm等为宜。本研究采用更精确的铺片方法，对此现象进行深入研究后再次发现，50μm深度切削属较浅，而100μm深度则过深，只有80μm较为适宜。在80μm切削深度下，能够保持完整的节段层、ONL、OPL，且在片层内侧残留少许的内核层，说明80μm切削深度较为可靠，这一结果与Huang［2］等报道相似。本研究同时发现，在对视网膜片行切削前，湿房的制作非常重要。因为液体既可以防止视网膜植片的干燥和皱缩，又可防止激光切削过程中表面液体蒸发过快，因此对进行精确深度切削至关重要［6］。Huang［2］等也发现，在行准分子激光切削时，要确保恒定深度的感光细胞片层，应始终维持视网膜片表层的液体平面。
3.3新出生期视网膜切削时应注意的问题新出生期视网膜虽已具备成年视网膜全层结构，但其内外网状层较厚和疏松，体现在视网膜神经细胞神经纤维发育的不成熟，而这一结构特点使得行激光切削时由于冲击力作用，直接影响到感光细胞片层的切削深度，成为激光切削存在的诸多问题之一［7］。故在行此期的视网膜激光切削时，在PTK各项参数均确定的前提下，所选深度应小于成年视网膜的切削深度，否则较易损伤感光细胞层，且会出现多种影响感光细胞片层质量的情况。
(本文图片见封三)（略）
参考文献
1Tezel TH,Kaplan HJ.Harvest and storage of adult human photoreceptor cells :the vibratome compared to the excimer laser.Curr Eye Res,1998,17:748-756.
2Huang JC,Ishida M,Hersh P,et al.Preparation and transplantation of photoreceptor sheets.Curr Eye Res,1998,17:573-585.
3Kaplan HJ,Tezel TH,Berger AS,et al.Human photoreceptor transplantation in retinitis pigmentosa.A safety study.Arch Ophthalmol,1997,115:1168-1172.
4李根林，王钢，王津津，等.视网膜定位联合液相铺片法用于感光细胞片层制备研究.中华眼科杂志，2002，38：119-120.
5John E，Dowling著.吴淼鑫，杨雄里译.视网膜.上海：上海医科大学出版社，1989，8-14.
6李根林，王刚，陆文秀，等.准分子激光不同切削深度制备感光细胞片层研究.中国实用眼科杂志，2000，18：384-386.
7李根林，王刚，王津津，等.准分子激光切削视网膜制备感光细胞片层时存在的一些问题.眼科研究，2001，19：32-34.
*基金项目： 国家自然科学基金(编号：30371510)，国家“十五”攻关专题计划基金资助项目(编号：2001BA705B10)，北京市自然科学基金(编号：7042020)
作者单位： 100730 北京 首都医科大学附属北京同仁医院眼科中心