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【摘要】 目的 观察神经细胞黏附分子(NCAM)在大鼠不同发育时期视神经及坐骨神经上的表达，探讨NCAM在视神经与坐骨神经分布的差异。方法 50只SD大鼠，按出生后天数分成5组，取部分视神经和坐骨神经，
免疫组织化学方法和计算机图像分析技术，测定大鼠视神经和坐骨神经NCAM表达。结果 NCAM在不同年龄大鼠视神经和坐骨神经均见表达。坐骨神经表达水平高于视神经。出生后7天组明显高于其他年龄组。结论 大鼠视神经和坐骨神经NCAM表达差异有显著性。
【关键词】 神经细胞黏附分子；视神经；坐骨神经；免疫组织化学；大鼠
Expression of NCAM in the optic nerve and sciatic nerve of rats
SUN Jian-hua,ZHU Yi-hua,ZHU Jie,et al.
Ophthalmology Department,Loudi City Centre Hospital,Loudi 417000,China
【Abstract】 Objective To investigate the expression of NCAM in the optic nerve and sciatic nerve of the rats during the different developing stages.Methods 50 SD rats were randomly divided into five groups.Both optic nerve and sciatic nerve were taken from them and determined the expression of NCAM by immunohistochemistry.The immunohistochemistry stainings were analyzed by automatic image analysis technology.Results The expression of NCAM in the sciatic nerve was higher than that in the optic nerve.The expression in the rats of 7days age was significantly higher than that in other groups.Conclusion The expression of NCAM in the optic nerve was significantly different from that of the sciatic nerve in the rats.
【Key words】 neuronal cell adhesion molecule;optic nerve;sciatic nerve;immunohistochemistry;rat
神经细胞黏附分子(neuronal cell adhesion molecule,NCAM),是细胞黏附分子的重要成分，具有高度黏附性。它介导神经元之间识别和黏附，在神经系统生长发育和神经再生中发挥着重要作用。本文采用免疫组织化学的方法，研究大鼠不同发育时期NCAM在视神经、坐骨神经内的分布及其变化，从而探讨视神经和坐骨神经的NCAM环境的异同及其与再生能力的关系。
1 材料与方法
1.1 动物材料 健康雄性Sprague-Dauley大鼠50只(福建医科大学实验动物中心提供)，按出生后7、15、30、45、60天分5组，每组10只。
1.2 标本的取材、固定和制作 大鼠用氯胺酮(10mg/kg)腹腔麻醉，眼科手术显微镜下，沿角巩缘全周剪开球结膜，各肌间钝性分离至球后，暴露视神经，取出眼球壁后视神经长约5mm。于股后部做正中切口，暴露梨状肌下缘至胫腓分叉处的坐骨神经段，切取坐骨神经长5mm。标本经中性福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋，作4μm厚石蜡切片。
1.3 HE染色 石蜡切片烤片过夜，常规脱蜡，苏木精染色，盐酸酒精分色，伊红染色，常规脱水后中性树胶封固。
1.4 免疫组织化学SP法 视神经、坐骨神经石蜡切片，使用SP-超敏试剂盒(福建迈新公司)染色。第一抗体NCAM Ab-1(1∶100)为美国NEOMARKERS公司产品。AEC显色，苏木精对比染色，水性封片。切片在同一条件下进行。以PBS代替一抗作为阴性对照。以大脑阳性片作阳性对照。
1.5 图像分析 光镜下，依着色强度分为强阳性、阳性、弱阳性、极弱阳性和阴性。标本经Video Pro32彩色图像分析系统(澳大利亚Leading Edge Pty Ltd)处理，每组取10张不同样本切片，置于光镜(×40)下，每张切片取3个视野，通过彩色图像分析系统，分别测量平均光密度值(OD)。
1.6 统计学方法 对所得的数据进行统计处理，用均数±标准差（±s）表示。比较NCAM在大鼠坐骨神经及视神经表达的平均光密度值，采用独立样本比较t检验，不同发育时期OD值比较采用方差分析、Post Hoc t检验，P＜0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 HE染色
2.1.1 视神经(纵切片) 有髓神经纤维，纵行走向，纤维细小、结构致密，无清晰的基膜。神经胶质细胞沿纤维走向呈散在的列队状排列。出生后随着年龄增加，胶质细胞数量减少，排列疏散零乱。
2.1.2 坐骨神经(纵切片) 有髓神经纤维，纵行走向，纤维较粗大、结构较疏松，可见清晰的基膜。雪旺细胞与神经内膜紧密相连，顺纤维走向散在分布。出生后随着年龄增加，胶质细胞数量减少，纤维变粗大、相对疏松。
2.2 NCAM免疫组织化学染色
2.2.1 NCAM在坐骨神经中的表达 NCAM抗体的阳性反应产物呈红色，在不同发育时期坐骨神经膜上，呈不规则的线状分布。随着年龄增加，反应强度逐渐减弱。其中7天组对抗体着色最深，反应为强阳性、深红色(见图1)。60天组对抗体着色较浅，反应产物表现为弱阳性、浅红色(见图2)。
2.2.2 NCAM在视神经中的表达 NCAM抗体的阳性反应产物呈红色，分散在视神经胶质细胞表面。在大鼠出生后60天内，随着年龄增加，对NCAM抗体的反应强度逐渐减弱。在5个年龄组，7天组对抗体的反应略强、着色较深(见图3)，60天组表达最弱(见图4)。
2.3 计算机图像分析 NCAM在大鼠坐骨神经和视神经表达的OD值，见表1。坐骨神经表达水平明显高于视神经。
表1 NCAM在大鼠不同发育时期坐骨神经及视神经表达OD值 略
3 讨论
NCAM是细胞黏附分子的一员，属免疫球蛋白超家族。1987年首次获得NCAM的分子结构。NCAM分为三个区域：形成结合位点的氨基末端，含大量碳水化合物的中央区，以及与细胞膜相连的羧基末端区［1］。电镜下观察NCAM具有3条臂组成的“人”字岛形结构。进一步研究发现它有一绞链，绞链处5个Ig域和一个纤维粘连蛋白结合在一起。由于这个结构NCAM能根据细胞间的相互作用及方向，在细胞之间进行一定程度的转动［2］。
NCAM主要存在于神经系统中，NCAM在所有分化了的神经细胞以及某些星形胶质细胞中，基本上都有发现。它位于神经元表面，和邻近细胞的其他NCAM分子结合，介导神经元之间同型识别和黏附。NCAM在神经系统发育和神经再生中发挥重要作用［3］。
在胚胎发育过程中，NCAM广泛分布，表明NCAM参与许多发育过程。神经系统的正常发育依赖于细胞与其局部环境间复杂的相互作用，这些相互作用受NCAM等细胞黏附分子的介导。在神经元发育中，NCAM参与黏附与轴突生长及延伸，并能促进突触的可塑性。如在视投射发育过程中眼内注入抗NCAM抗体，引起视神经紊乱，导致视网膜与脑之间异常的神经连接［1］。
体外神经元培养的研究发现：NCAM能刺激神经元轴突延伸。小脑神经元在转染了NCAM cDNA的3T3细胞后，生长得更快，轴突分支也更多［4］。实验发现NCAM抗体能阻断横切的坐骨神经再生［5］。NCAM促进轴突生长的原因可能是它们通过为神经元突起生长提供更具黏附性的基质而起的机械性作用，或者它们的相互作用可能启动了能刺激轴突延伸的细胞内信号。近年认为NCAM激活神经元第二信号级联反应而激发神经生长［6］。
文献报道大鼠脑中NCAM mRNA的高峰接近于出生时期，而在随后的发育过程中降落了大约80%［2］。本研究发现NCAM在大鼠坐骨神经及视神经中均有表达，并且NCAM在大鼠坐骨神经中大量表达。大鼠越年幼，表达水平越高，随着年龄增加，表达水平相对下降，到发育晚期或成熟期其表达明显下降。NCAM在坐骨神经的表达与雪旺细胞(SC)的生物学功能密切相关。SC是重要的神经胶质细胞，包绕坐骨神经轴突，并形成髓鞘，与其周围存在的生物分子共同构成坐骨神经的微环境。存活的SC能持续表达NCAM分子［7］。在胚胎期SC能高水平的表达NCAM［3］。SC及其分泌的蛋白质等构成的微环境，使坐骨神经再生变得容易。
Anderson等的研究显示NCAM在胚胎视神经较多表达，出生后在视神经的表达为低水平［8］。本研究发现NCAM在大鼠视神经表达明显较坐骨神经弱，二者差异有显著性，并且随着年龄增加，表达水平明显下降，30～45天后表达更少，这可能与视神经再生能力相对较弱有关。由于不同的神经细胞有不同空间和时间的NCAM基因表达，NCAMmRNA又经历不同的剪接，因而在不同的发育时间可表现出不同的细胞黏着性。NCAM结构差异会导致结合力不同。
有学者认为中枢神经再生困难可能与其缺少细胞外基质、细胞黏附分子等适宜的环境有一定关系［9］。NCAM介导的细胞间的相互作用是再生过程的一个重要环节。由于视神经与坐骨神经存在细胞外环境的差异，导致它们再生能力不同。曾有实验将周围神经移植或SC移植到受损的视神经，改变视神经环境，能显著促进视神经再生［10］。因此改善视神经再生环境，是研究神经再生的关键问题，增强NCAM表达、人为地提供适宜视神经修复和再生的微环境，可能为视神经损伤的修复开辟一条新途径。
（本文图片略）
【参考文献】
1 阿德尔曼.神经科学百科全书.上海：上海科学技术出版社，1992，821.
2 左明雪.细胞和分子神经生物学.北京：高等教育出版社，2001，284.
3 Fercakova A，Kosice,Slovakia.Cell adhesion molecules in the neural development and plasticity.Bratisl Lek Listy,2001,102(12):552-555.
4 蔡文琴.发育神经生物学.上海：上海科学出版社，1999，60.
5 Remsen LG,Strain GM,Newmkan MJ,et al.Antibodies to the neural cell adhesion molecule disrupt functional recovery in injured nerves.Experimental neurology,1990,110:268-273.
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8 Anderson PN,Campbell G,Zhang Y,et al.Cellular and molecular correlates of the regeneration of adult mammalian CNS axons into peripheral nerve grafts.Prog Brain Res,1998,117:211-232.
9 成军.细胞外基质的分子生物学与临床疾病.北京：北京医科大学出版社，1999，211-212.
10 Negishi H,Dezawa M,Oshitari T,et al.Optic nerve regeneration within artificial schwanns cell graft in the adult rat.Brain Res Bull,2001,55(3):409-419.
基金项目：福建省科技厅重大科研项目(2000F005)
作者单位：1 417000 湖南娄底，娄底市中心医院眼科
2 350005 福建福州，福建医科大学附属第一医院眼科
3 353000 福建南平，南平市第一医院眼科
(编辑：陆 华)