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【摘要】 目的 通过观察糖尿病患者老年性白内障和老年性白内障晶状体上皮细胞（lens epithelial cells,LECS)形态学的变化，探讨糖尿病患者老年性白内障发生的相关机制。方法 收集16例糖尿病患者的老年性白内障眼的晶状体前囊膜上皮分为两组，15例进行HE染色，光学显微镜观察，1例制片电镜观察；对照组取16例老年性白内障眼的晶状体前囊膜上皮分为3组，15例进行HE染色，光学显微镜观察，1例制片电镜观察。结果 （1）糖尿病患者老年性白内障组晶状体上皮细胞形态改变明显，细胞发生明显凋亡和异常增殖。（2）对照组老年性白内障组晶状体上皮细胞形态学改变与细胞凋亡、异常增殖发生不明显。结论 与老年性白内障相比：糖尿病老年患者晶状体前囊膜上皮细胞凋亡发生几率高，有大量细胞增殖。晶状体前囊膜上皮细胞凋亡可能是糖尿病患者老年障形成的形态学基础。
【关键词】 糖尿病；白内障；晶状体前囊膜上皮细胞；细胞凋亡
Experimental study on morphological changes in diabetic senile cataract and senile cataract
QIU Lu-lu,ZHENG Qiu-ping.
Hongqi Hospital,Heilongjiang 157000,China
【Abstract】 Objective To observe morphological changes of lens epithelial cells(LECs)in diabetic senile cataract,in order to investigate the pathogenic mechanism of diabetic cataract.Methods 16 epithelials of lens anterior capsules of diabetic senile cataract were divided into two groups,15 were stained with HE and examined with light microscopy.1 was examined with transmissional electron microscope.The same examination in 16 epithelials of lens anterior capsule in senile cataract was carried out.Results Morphological changes occurred markedly in diabetic senile cataract. Apoptotic of lens epithelial is the morphological base of senile diabetic cataracts.Conclusion Comparing with senile cataract:(1)Percentage of a poptotic and proliferative was markedly increased.(2)Apoptotic of lens epithelial is the morphological base of diabetic senile cataracts.
【Key words】 diabetic;cataract;lens epithelial cells;apoptotic
糖尿病患者老年性白内障是糖尿病眼部病变致盲的重要原因，占糖尿病致盲性疾病的第二位，对其发病机制进行研究，寻找有效地防治途径一直是眼科学界致力研究解决的重要课题，其经典的发病机制包括渗透损伤学说、晶状体蛋白的非酶基氧化学说。近年来Li等研究发现过氧化氢、紫外线和钙离子均可诱发晶状体上皮细胞凋亡，并认为晶状体上皮细胞凋亡是人类和动物非先天白内障共有的细胞学基础。本实验研究通过对糖尿病患者老年性白内障晶状体上皮细胞的观察实验进一步证实：糖尿病患者老年性白内障的发生与晶状体上皮细胞凋亡有关。
1 资料与方法
1.1 一般资料
1.1.1 实验组 选择2004年2～4月住院的患糖尿病的老年性白内障患者16例16眼，男10例，女6例，既往无眼外伤或其他眼部疾病，年龄55～78岁，平均（64±2.5）岁，入院时已在内科确诊为2型糖尿病，血糖在7.8～13.7mmol/L之间，尿糖（+～++++），病程5～6年不等，经内科药物治疗后，血糖控制在8.3mmol/L以下，尿糖转阴。
1.1.2 对照组 选择2004年2～4月期间住院的老年性白内障患者16例16眼，年龄55～78岁，平均（64±2.5）岁，无其他可引起白内障的疾病因素，既往无眼部疾病史。
1.2 取材 实验组与对照组的取材患者均在术前常规冲洗泪道、结膜囊。进入术间后平卧于手术床上，常规碘伏、酒精消毒，铺一次性眼科孔巾，开睑器开睑，滴表面麻醉剂，实施白内障超声乳化人工晶体植入术，术中作角巩膜缘切口，前房注入黏弹剂，划囊后环形撕取6mm大小前囊膜，即用30℃平衡盐液冲洗，做HE染色组用75%酒精固定，送至病理教研室制片，做电镜组用2.5%戊二醛液固定送至电镜室。
1.3 试剂 平衡盐液：牡丹江温春制药厂；医用透明质酸钠：上海其胜生物制剂有限公司；2.5%锇酸固定液。
1.4 主要仪器设备 手术显微镜：Moller-WEDEL，光学显微镜（型号：Olympus cx40，日本制造）、H-600透射镜（日本制造）；LKB-V型超薄切片机（日本制造）。
1.5 方法
1.5.1 光学片制备 实验组与对照组均为15例，取自白内障超声乳化人工晶体植入术中环形撕取的6mm大小的前囊膜组织，用30℃平衡盐冲洗后放入75%酒精中固定，送至病理教研室制片，具体操作如下：90%酒精固定12h；100%酒精2次各1h；二甲苯2次各1h；温箱中浸蜡2次各1h包埋，切片，平铺展片后送至温箱中烘干2h；二甲苯中脱蜡2次各5～15min；无水乙醇2次5～15min；酒精浓度依次为100%，95%，80%，75%各1min。蒸馏水洗2min。苏木素染色5～15min冲洗3遍后用盐酸乙醇分化30s，酒精浓度依次为95%，95%，100%，100%各1min，二甲苯石炭酸2次各1min。滴树胶1滴后盖玻片封片。
1.5.2 透射电镜片制备 实验组与对照组均取1例前囊膜上皮，用2.5%戊二醛磷酸缓冲液固定1～3h后，用磷酸盐冲洗液反复多次清洗组织，冲洗3h以上，以彻底洗去醛类溶液，冲洗毕用1%锇酸固定1～2h，用乙醇梯度脱水，100%丙酮浸透，环氧树脂包埋，制片。将铺于铜网上的切片经枸橼酸铅及醋酸双氧铀染色后，用透射电镜观察对照组。
1.6 统计学方法 各组实验数据结果用t检验，精确概率法进行统计学处理。
2 结果
2.1 糖尿病患者老年性白内障（DSC）组晶状体上皮细胞的形态学观察 光镜下：（1）形态异常的细胞散在分布较多，表现为：胞质疏松淡染，空泡形成（见图1、图2）。（2）凋亡细胞在组织中单个散在分布较多，表现为：染色质致密浓缩，核碎裂等（见图3）。（3）有大量细胞增殖（见图4）。
2.2 老年性白内障（SC）组晶状体上皮细胞的形态学观察 光镜下：（1）形态异常细胞较少见，胞质呈均质状，偶见胞质疏松，空泡（见图5）。（2）凋亡细胞在组织中单个散在分布少见（见图6）。（3）增殖细胞少见（见图6）。
2.3 DSC组与SC组两组比较 见表1、表2。
表1 DSC组与SC组临床表现出的频数比较（略）
表中的定级由临床表现出的频数决定，“-”代表出现频数为1%～20%；“+”为20%～40%；“++”为40%～60%；“+++”为60%～80%；“++++”为80%～100%。
表2 SDC组与SC组细胞情况比较 （略）
用精确概率法进行统计学处理，P均<0.05，SDC组与SC组相比差异有显著性。
2.4 透射电镜下 正常晶状体上皮细胞形态：形态规则，细胞膜结构清晰，与相邻细胞及晶状体囊膜结合紧密，细胞质及染色质均匀无凝缩（见图7）。凋亡上皮细胞形态：与相邻细胞及晶状体囊膜疏松结合，细胞核染色质凝聚在核膜周围，细胞质浓缩（见图8）。
图1 SDC晶状体前囊膜上皮细胞排列相对紊乱，有异常细胞增殖，细胞密度不均 HE×200（略）
图2 SDC细胞有大量细胞重叠现象，胞质肿胀 HE×400（略）
图3 SDC细胞大小不均，核边集，有凋亡小体，即染色质致密浓缩，核碎裂 HE×400（略）
图4 SDC晶状体前囊膜上皮细胞排列紊乱，异常增殖 HE×100（略）
图5 SC细胞有少许细胞重叠，胞质肿胀 HE×100（略）
图6 SC晶状体前囊膜上皮细胞，细胞排列整齐，少许增殖和凋亡细胞 HE×200（略）
图7 透射电镜下正常晶状体上皮细胞的超微结构 ×7200（略）
图8 透射电镜下晶状体上皮细胞凋亡的超微结构 ×10000（略）
3 讨论
糖尿病患者所患的白内障是糖尿病眼部病变致盲的重要原因，对其发病机制进行研究寻找有效防治途径一直是眼科界致力研究解决的重要课题。其发病机制有很多学说，包括渗透损伤学说、晶状体蛋白的非酶糖基化学说及氧化损伤学说［1］，近年来Li等研究认为LEC凋亡是人类和动物非先天性白内障共有的细胞学基础［2］，本研究观察了老年人糖尿病患者所患的白内障和老年性白内障细胞凋亡情况，进一步证实了糖尿病患者白内障的发生与细胞凋亡关系密切。
3.1 正常LEC形态和功能 晶状体上皮细胞是晶状体代谢最活跃的部位，它担负着晶状体的生长、分化和损伤修复作用，与白内障的发生发展有密切关系。晶状体前囊膜的上皮为一层单纯的立方上皮，11～17μm宽，5～8μm高，散布在前囊下到赤道部为止的一段距离内［3］大多数文献报道认为，晶状体上皮细胞通过消耗葡萄糖和氧，产生能量来维持晶状体碳水化合物和氨基酸的运输，提供在晶状体赤道部形成晶状体纤维所需蛋白质的能量，并含有大量保护晶状体免受氧化损伤的酶系统。所以晶状体上皮细胞的损伤或老年性改变均会影响纤维的生理功能，导致晶状体混浊［4］。
3.2 凋亡细胞的形态 HE染色后，凋亡细胞在光镜下表现为核染色质致密浓缩、核碎裂等。坏死组织则呈均质红染的无结构物质，核染色消失。电镜下表现为细胞核染色质凝聚在核膜周围，细胞质浓缩［5］。
3.3 老年性白内障晶状体上皮细胞形态学改变与细胞凋亡 本研究表明白内障组上皮细胞一部分与正常上皮细胞无明显差别，一部分有轻度异常，表现为细胞肿大、细胞质淡染，有的浓染缩小，在标本中可见到多少不等的细胞重叠现象，一般为1～3个细胞重叠，与Konofsky等报道的结果相似，在光镜下可见上皮细胞有变性改变，表现为偶见细胞肿大，胞质疏松甚至空泡形成，细胞核大小不一，与变性改变同时存在有细胞增生的表明，Li等的观察表现，在44～94岁的白内障中上皮细胞凋亡发生率为4.4%～41.8%，而正常晶状体的LEC中未发现凋亡细胞，因此各种刺激因素引起的细胞变性、死亡或凋亡，可能是晶状体上皮细胞变性、细胞密度下降的原因。而光镜下细胞凋亡表现为细胞染色质浓缩，并靠近核膜，产生核边集现象，核膜裂解，染色质断裂，产生凋亡小体等典型的细胞凋亡形态学变化，而本研究中核染色体呈块状的异型性正是细胞凋亡的形态学改变。
3.4 糖尿病患者老年性白内障的晶状体前囊膜上皮细胞形态学改变与细胞凋亡 与SC相比，研究表明，SDC中异形细胞较多，胞质疏松，空泡较多，染色质块状较多，重叠细胞较多，大小不均，排列紊乱，细胞增殖比SC增多，表明凋亡细胞比率增加，经典学说认为糖尿病高血糖主要通过渗透性水肿，形成非酶糖化终产物及氧化损伤导致糖尿病性白内障的发生［6］，笔者的研究表明SDC的晶状体上皮细胞凋亡增加，与SC相比其LEC凋亡百分率有显著意义。糖尿病所致LEC凋亡的具体途径，并未做深入研究，但已有相关研究报道：高血糖及并发的细胞高渗透状态可改变bcl-2,bax等凋亡调控基因的表达，诱导细胞凋亡的发生：Lin等亦证实高浓度的葡萄糖能使细胞膜脂质过氧化，细胞内活性自由基增加，它们可通过诱导氧化应激介导细胞凋亡［7］。此外，晶状体上皮细胞内钙离子显著增加亦被认为是高血糖诱发细胞凋亡的重要机制之一，最近Takamura等在其糖尿病性白内障的研究中提出晶状体在解剖和生理方面有其特殊性，它是相对不受血管、淋巴管影响的单一细胞组成的独立的组织结构，因此，从它较少接受其他细胞信息也能生存这点来看，晶状体上皮细胞自己能产生抑制细胞死亡的因子，即晶状体上皮细胞能自主地发现凋亡并进行调整，从而阻止过度凋亡［8］，总之高血糖、年龄增长及外伤等原因可能继发性地将这种控制功能破坏，从而导致LEC凋亡。
综上所述，晶状体上皮细胞是贴附于晶状体前囊面的单层上皮，晶状体的正常代谢有赖于其晶状体上皮细胞结构、数目与功能的完整性。晶状体上皮细胞凋亡必定会引起屏障功能的破坏，晶状体内环境代谢失衡，最终导致白内障。糖尿病患者血糖升高可使晶状体上皮细胞凋亡，异常增殖，且SOD活性降低，抗氧化酶的失活可促进细胞凋亡，这可能是糖尿病性白内障发生的又一相关机制。
4 结论
与老年性白内障相比；糖尿病老年性白内障患者晶状体上皮细胞凋亡发生几率高，有大量细胞增殖。晶状体前囊膜上皮细胞凋亡可能是糖尿病患者老年性白内障形成的形态学基础。
【参考文献】
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7 Lee EH,Wan XH,Song J,et al.Lens epithelial cell death and reduction of anti-apoptotic protein in human anterior polar cataracts.Mol Vis,2002,11(8):235-240.
8 Li WC,Kuszak JR,Wang GM. Calaim ycin-induced lens epithelial cell apoptosis ntributes to cataract formation.Exp Eye Res,1995,16(1):91-98.
(编辑：唐 城)
作者单位： 157000 黑龙江牡丹江，牡丹江医学院附属红旗医院眼病中心