OPTN基因与原发性开角型青光眼

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   ［摘要］  2002年Rezaie等报道了OPTN基因的突变可能导致POAG正常眼压性亚型，并推测OPTN基因在视神经损害过程中可能起到保护作用。本综述主要介绍了该基因的定位、克隆、结构、功能以及突变的研究。

    ［关键词］  OPTN；基因；青光眼；定位；克隆；功能；突变

    青光眼是第二大致盲疾病，其中至少50%是原发性开角型青光眼(primary open angle glaucoma，POAG)［1］。不同种族POAG的发病率是不一样的，黑人的发病率约为白种人的4倍。同时，POAG的发病具有明显的家族聚集的特征，POAG的亲属患病率远高于正常人群的发病率［2］。这种种族分布的不均衡性以及家族聚集的特点提示POAG的发病与遗传相关联。

    在分子遗传学方面，陆续已发现近10个基因座与POAG发病相关，这些基因的发现为揭开青光眼发病机制开辟了新的一页。1998年Sarfarazi 的研究组确定了1个新的POAG致病基因座GLC1E,位于10p15p14 ［3］。2002年Rezaie等［4］报道了GLC1E基因座上optineurin（optic neuropathy inducing,OPTN）基因的突变可能导致POAG正常眼压性亚型，发现16.7%的遗传性的POAG患者伴有OPTN基因的突变，并推测OPTN基因在视神经损害过程中可能起到保护作用。

    1  OPTN基因的定位

    1998年［3］，Sarfarazi 小组通过对一个包含4代18个发病患者的51名成员的青光眼家系(POAG-90)的遗传学调查及专科检查确定该家系发病类型为正常眼压性青光眼，属常染色体显性遗传遗传方式。进而抽提基因组DNA，用特异性引物PCR扩增，进行基因连锁分析。最初他们选用一系列已知的与青光眼相关基因座上的遗传标记筛查，未发现家系成员与这些标记存在连锁关系。而且，对该家系先证者的TIGR基因突变的筛查也没有发现突变。在随后更广泛的筛查中，发现家族与10号染色体短臂上的短串联重复序列标记（shorttandemrepeat polymorphism，STRP）D10S1172存在连锁。于是他们选用位于同样区域内的23个标记筛查，结果位于10p15-p14区域内的22个STRP与家系成员的连锁系数LOD>3（LOD=3.77~10），提示致病等位基因与该STRP连锁。进一步分析表明GLC1E基因座位于STRP标记D10S1729 (Zmax=5.55; θ=0.04)和D10S1664 (Zmax=6.04;θ=0.03)相邻的21 cM的区域内。一系列已知的基因位于这个区域内，包括：NET1、PRKCT、ITIH2、IL2RA、IL15RA、IT1H2、hGATA3、KIAA0019基因的开放阅读框以及D123蛋白的基因。经进一步分析［4］，后选基因被锁定在包含5个后选基因的5 cM的范围内。在排除了其他4个基因后确定OPTN基因为导致POAG发病的致病基因。与人类基因组相似的GLC1E基因座区域，也被定位在了老鼠的2号染色体上。

    2  OPTN基因的克隆及表达

    OPTN基因曾被作为FIP2、TFIIIA-INTP和NRP基因进行研究。

    C组人类腺病毒Ad的E3区（Early region 3）编码多种肿瘤坏死因子alpha（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）抑制子［5］，特别是一种E3 14.7-kDa蛋白(E3-14.7 K)。为阐明该蛋白抑制TNF-α诱导凋亡的机制，Yongan Li［6］等在酵母双杂交系统用E3-14.7 K筛选海拉细胞cDNA文库时发现了一种包含多个亮氨酸拉链结构的新的蛋白，命名为14.7 K相干蛋白（14.7 Kinteracting protein，FIP-2）。

    2000年，Moreland RJ等［7］学者克隆出了同样的基因。已经知道真核细胞中转录因子IIIA (TFIIIA)能激活5S核糖体RNA基因的转录［8］。有脊椎动物的TFIIIA蛋白结构包含9个半胱氨酸-组氨酸锌指结构，其主要功能为核酸的黏附［9，10］，而TFIIIA的羧基末端参与转录活动。为查明参与TFIIIA作用过程的成分，笔者使用TFIIIA蛋白羧基末端为诱饵，通过酵母双杂交系统，在小鼠的cDNA文库中，诱导出与其相互作用的成分，并将其命名为转录因子IIIA相干蛋白（TFIIIAinteracting protein，TFIIIAintP），并且为了验证该蛋白是不是所要寻找的目标，笔者还用TFIIIAintP抗体与TFIIIAintP相互反应，通过免疫沉淀试验验证。结果他们发现了一种分子量为70.6 kD新的蛋白，全长617氨基酸，结构中包括大量亮氨酸拉链结构和亮氨酸富集区。在该蛋白羧基末端553-582氨基酸处，有一个半胱氨酸-组氨酸锌指结构。研究还发现小鼠的TF3AintP与人类具有85％的同源性，特别是一个长度为36个氨基酸，一级结构完全相同的亮氨酸富集区。

    同年，Schwamborn K等［11］发现了一种与NEMO蛋白（NF-κB Essential Modulator,NEMO）高度同源的蛋白，命名为NRP (NEMOrelated protein)。NEMO蛋白在诸如细胞免疫、炎症、细胞凋亡等生理过程中扮演重要角色［12,13］。他们发现这种分子量为67-kD的蛋白，53％与NEMO同源。试验还证实NRP的表达会被干扰素和TNF-α诱导。并在这两种因素的刺激下，NRP的表达将呈明显上调反应。另外，他们还意识到NEMO蛋白可能和高尔基器有关。笔者发现NRP的羧基末端的锌指结构能替代NEMO蛋白的功能。

    OPTN基因的表达已经被研究过。Yongan Li［6］发现FIP2基因表达在人类的心脏、肝脏、肾脏、骨骼肌以及胎盘的脏器中。最近的研究［4］发现OPTN基因还在人类的小梁网、非色素睫状上皮细胞、视网膜以及肾上腺皮质、胎儿、淋巴细胞、纤维细胞中表达。Northern杂交试验检测到两种mRNA的表达，大部分是2.0-kb的成分，丰度高于分子量为3.6-kb的3~4倍。同时Rezeiz等用免疫组化方法再次证实，OPTN蛋白富集于高尔基器，认为OPTN蛋白是一种分泌蛋白。OPTN基因结构，见图1。

   OPTN基因共有16个外显子组成。含13个编码外显子和3个位于5’端的非翻译外显子。开放阅读框共有2077 bp，编码577个氨基酸。OPTN基因的5’端共有3种不同的同族异构结合区，Genebank序列号分别为AF420371，AF420372，AF420373但是它们都有相同的开放阅读框。已经证实，老鼠的OPTN基因与人类的78％同源，编码584个氨基酸。OPTN基因结构中有3个已知的重要的功能域，即：位于4、5外显子的基本亮氨酸拉链转录因子［14］(basic leucine zipper transcription factor,bzip)，10、11外显子的亮氨酸拉链结构［15］（leucine zipper,LZ）和位于OPTN蛋白羧基末端的锌指功能域(ZF-C2H2)［16］。研究证实［17～19，20］，这些特殊的功能域与核酸的黏附有很大关联。

    3  OPTN基因功能的研究

    OPTN蛋白的功能以及与青光眼发生病理的机制还不很清楚。最初的研究中［7］，学者们注意到无论在体外的GST蛋白黏附测验还是在体内的免疫沉淀试验都能观察到FIP-2 克隆与E3-14.7 K 蛋白相互作用。FIP-2能引起E3-14.7 K 重新分布到细胞核的周围。试验中还发现在人类胚肾293细胞FIP-2能够阻断E3-14.7 K对TR55(TNF recepter 55)杀伤的保护作用，而且这种抑制作用依赖于FIP-2 与14.7 K的相互作用。另外，FIP-2 的表达能够被TNF-α诱导，并表现出时间依赖的方式。研究者推测FIP-2可能是TNF-α信号途径中的一个重要的组成部分。而在E3-14.7 K 和外源性TR55缺乏的情况下，FIP-2的高表达并不能激活细胞死亡。因此FIP-2可能是利用了一些细胞因子来激活细胞的凋亡，能够将平衡移向凋亡的方向。

    TNFα在眼睛中的作用，分布及其对眼疾病的潜在影响已经被研究过。例如在青光眼患者的视乳头TNFα和TNFα受体R1的表达均明显上调［22］。现在已知道神经胶质细胞在缺血、机械拉伸、升高流体压力等已知的导致神经节细胞变形的因素的刺激下，分泌TNFα将明显增加［23］。另外，一种遗传性视网膜变性模型的老鼠上，也发现TNFα处在高水平的状态。种种迹象说明TNFα在青光眼视神经节细胞的凋亡中起到特殊的作用。在小梁网，金属蛋白酶金属蛋白组织抑制物是小梁网外流装置的关键调控子［15］，而TNFα调控着金属蛋白酶和金属蛋白酶组织抑制物的表达。

    FIP-2还参与了细胞塑形的过程。有证据显示FIP-2在舞蹈病蛋白（Huntingtin）与Rab8蛋白的联系中起某种作用，形成一种复杂的调控细胞膜交换和形态发生学的机制。试验表明，在小梁网细胞，FIP-2蛋白可能与Huntingtin和Rab8蛋白形成复合物。而Rab8是一种已知的引起细胞基本形态改变的小GTP酶。而其他的研究［24］也已经证实Rab8和FIP-2（OPTN）均可以引起纤维肉瘤HT80细胞的突起生长，因此学者们推测FIP-2（OPTN）和Rab8和Huntingtin有调控细胞形态发生的作用。

    OPTN保护作用的依据还不充分，Rezaie［4］等通过分子遗传学的调查，发现OPTN基因突变型在POAG患者中的发现率远高于正常对照组，统计学相差非常显著。Rezaie等的资料清晰的显示OPTN基因突变是许多POAG的发生原因。另外，他们还发现体外培养的OPTN基因E50K突变的病人中真皮纤维细胞产生的OPTN蛋白量显著低于正常人真皮纤维细胞。因此推测野生型OPTN蛋白应该起到的是一种保护性的作用。

    Jason L等［24］ 学者观察了在高眼压、TNFα刺激、地塞米松处理等多种青光眼高危因素条件下，体外培养的小梁网细胞中OPTN基因的表达情况，发现在第二天OPTN基因表达开始增加，在第七天表达达到顶峰（＋57％），与以前报道的小梁网自身的生理反应机制相吻合，但当生理反应已经消失的情况下，OPTN基因表达的反应仍然存在。结合OPTN基因突变型相对野生型更容易导致POAG的发生。作者推测在小梁网细胞，高表达的OPTN也不太可能是一种损害性的作用，而是通过改变细胞骨架的形态，降低房水外排的阻力，增加外流的。

    综上所述，OPTN在眼睛中的作用还没有完全阐明。已经明确的是OPTN蛋白是TNFα信号传导途径中的重要一员，在视神经中它可能平衡或者调控E3-14.7 K蛋白以及TNFα的功能。不同条件下OPTN也许起到的是诱导凋亡或保护抑制凋亡这样完全相反的作用。

    4  OPTN基因突变的研究

    Rezaie［6］等筛查了54个正常眼压青光眼(Normal tension glaucoma,NTG)家系，发现4种OPTN基因外显子突变。家系中13.5％（7／52）的NTG患者在 458位发生G>A的碱基替代，导致错义突变。2.2％（1／46）的患者出现691~692碱基之间的AG碱基插入，导致移码突变。1／46的患者出现1944位G>A 的突变。17.8％（8／45）家系患者和12.1％的散发个体发现603位碱基T突变为A,平均占POAG患者的13.6％，而在9／422（2.1％）正常人群中也发现同样的突变。见表1。

    5  OPTN基因的研究前景和展望

    OPTN的发现为深入了解青光眼发病机制和找到一个更有效的治疗手段提供了一个新的路径。虽然目前对OPTN的认识还处于很肤浅的阶段，但是已经了解OPTN与包括Huntington、Rab8、E3-14.7 K在内很多重要蛋白的相互作用，以及OPTN在TNFα诱导凋亡的机制中扮演重要的角色，甚至可能是TNFα信号转导过程中的关键成分。因此未来的研究搞清楚OPTN在TNFα诱导凋亡的机制中到底起什么样作用就是一个关键。令人感兴趣的还有TIGR蛋白也是视神经保护的一个成分，是否众多致病基因导致青光眼机制中最终将走入一个共同的路径？也是我们研究的一个方向。最近，Vincent［25］等的工作揭示了CYP1B1基因对TIGR基因起着潜在的调控作用。所以我们想要知道OPTN在众多青光眼基因中是否是一种调控子，或者是被其他青光眼表1  OPTN sequence alterations in hereditary adultonset POAG有很长的路要走，但是就象Sarfarazi教授大胆预测的那样，OPTN的研究可能为彻底战胜这种疾病开辟了光明的前景。

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    作者单位： 400042 重庆，第三军医大学大坪医院野战外科研究所眼科

　　  (编辑：江  枫)