Literature
Home医源资料库在线期刊滨州医学院学报2005年第28卷第2期

米帕明对谷氨酸损伤中枢神经细胞的保护作用

来源:滨州医学院学报
摘要:【摘要】目的研究米帕明(Imi)对谷氨酸损伤培养大鼠皮层神经细胞的保护作用。方法分离培养15~18d胎龄的大鼠神经细胞,加入谷氨酸(Glu),观察谷氨酸对神经细胞的损伤作用及米帕明的保护作用。结果加入谷氨酸后,神经细胞出现明显损伤性变化,死亡率升高,培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)、一氧化氮(NO)含量增加,细胞......

点击显示 收起

    【摘要】    目的    研究米帕明(Imi)对谷氨酸损伤培养大鼠皮层神经细胞的保护作用。方法    分离培养15~18 d胎龄的大鼠神经细胞,加入谷氨酸(Glu),观察谷氨酸对神经细胞的损伤作用及米帕明的保护作用。结果    加入谷氨酸后,神经细胞出现明显损伤性变化,死亡率升高,培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)、一氧化氮(NO)含量增加,细胞匀浆中丙二醛(MDA)生成增加,超氧化物歧化酶(SOD)含量明显减少。Imi能不同程度地减轻上述损伤性变化。结论    Imi对谷氨酸所致的神经细胞损伤具有保护作用,其作用机制可能与钙拮抗作用有关。

    【关键词】    米帕明;谷氨酸;大脑皮层神经细胞;细胞培养

    Protective effects of imipramine on glutamate-induced neurotoxicity in cerebral cortical neuronal cultures

    XU Yong    JI Biansheng    SHI  Leming    et al

    Department  of Pharmacology,Binzhou Medical College,Binzhou 256603

    【Abstract】    Objective    To study the protective effects of imipramine (Imi) on glutamate-induced neurotoxicity in cultured rat cerebral cortical neurons.Methods    Cortical neurons of fetal of rat were cultured in vitro.The protective effects of Imi  on glutamate-induced neurotoxicity were  obserced.Results    Exposure of rat fetus cerebral cells to Glu medium developed a neurotoxicity expressed in the increase of LDH leakage and NO,MDA content and the decrease of activity of SOD,as well as the development of morphological injury.Imi protected neurons against above damage significantly.Conclusion    The results suggest that Imi prevents the toxicity of Glu.And it maybe attribute to its effect of anticalcium.

    【Key words】    imipramine,glutamate,cerebral cortical neurons,cell culture

    缺血性脑血管病是临床常见疾病,对其发病机制人们提出了多种学说,如钙超载学说、兴奋毒性学说、自由基学说等,其中兴奋毒性学说早已为人们所重视。谷氨酸(glutamate,Glu)是中枢神经系统内含量最高的兴奋性氨基酸,而几乎所有的神经细胞都有谷氨酸受体,因此任何引起胞外谷氨酸浓度异常增高的病理变化均会产生兴奋毒性。有研究发现[1],米帕明(imipramine,Imi)具有钙拮抗作用,对兔基底动脉有选择性舒张作用,因此考虑该药可能有脑保护作用。本研究利用培养大鼠皮层神经细胞,建立谷氨酸损伤模型,观察谷氨酸对神经细胞的损伤作用及研究Imi是否具有保护作用,并探讨其可能的作用机制。

    1    材料与方法

    1.1    材料    Wistar大鼠,孕15~18 d,由河南省实验动物中心提供。盐酸米帕明、多聚L-赖氨酸(相对分子量为150 000~300 000)、谷氨酸、噻唑兰(MTT)均为Sigma公司产品;DMEM高糖培养基、胎牛血清、马血清均为Gibco公司产品;盐酸阿糖胞苷为上海华联制药有限公司产品,批号990901;乳酸脱氢酶(LDH)、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒均为南京建成生物工程研究产品;总蛋白试剂盒为北京中生生物工程高技术公司产品。其余试剂均为市售分析纯。HERA cell二氧化碳培养箱(德国GmbH公司);SW-CJ-1F型净化工作台(苏州安泰空气技术有限公司);BH-NIC-B型倒置显微镜(日本Olympus Optical公司);722型分光光度计(上海第三分析仪器厂);DG5031型酶联免疫检测仪(华东电子管厂)。

    1.2    方法

    1.2.1    胚胎大鼠大脑皮质神经细胞培养[2]:孕15~18 d Wistar大鼠腹腔注射水合氯醛350 mg·kg-1麻醉,无菌条件下剖腹取出胎鼠,开颅取出大脑皮层放入预冷的DMEM培养基中,剔除软脑膜和血管,将脑组织移入含血清的DMEM培养基(含10%胎牛血清和10%马血清)的小烧杯中,用细口吸管反复轻轻吹打成细胞悬液,以200目不锈钢筛网过滤,并将滤液细胞数调至1×106个·ml-1,接种于经0.01%多聚L-赖氨酸过夜处理的细胞培养板中(24孔板接种1ml·孔-1,96孔板接种0.1 ml·孔-1),置37℃、5%CO2培养箱中培养。次日待细胞贴壁后换液1次并去除死细胞,以后每3~4 d换液1次。细胞培养至第6天时,加入终浓度10 μ mol·L-1阿糖胞苷以抑制非神经细胞的生长,18 h后换新的DMEM培养基继续培养。

    1.2.2    Glu对神经细胞的损伤[3,4]:取培养12~14 d的神经细胞,吸去原培养液,用无Mg2+Earlie液[(mmol·L-1):NaCl 143,KCl 5.4,CaCl21.8,NaH2PO41.0,葡萄糖5.6,HEPES 2.4,pH 7.4]洗2遍,每孔加入含Glu终浓度5×10-4mol·L-1的无Mg2+Earlie液1 ml(24孔板)、0.1 ml(96孔板),15 min后用DMEM培养基洗去Glu,再换用无血清的DMEM培养基,置37℃、5%CO2培养箱中继续培养24 h。正常对照组不加Glu,其余处理同上。给药组在损伤处理前24 h及处理过程中均加入不同浓度的Imi。

    1.2.3    MTT微量自动比色[5]:Glu损伤细胞后24 h,用MTT染色法测定细胞存活率。96孔细胞培养板于终止培养前每孔加入10 μl MTT(终浓度为0.5 g·L-1),继续培养4 h后,吸去上清液,加入二甲基亚砜(DMSO)100 μl溶解甲肷结晶,待其充分溶解后,用酶标仪测其OD值,检测波长为570 nm。细胞存活率(%)=OD值/对照组OD值×100%。

    1.2.4    LDH和NO的测定:细胞经损伤处理后,收集培养上清液,按文献方法[6,7],参照试剂盒说明书测定培养液中LDH活性、NO含量。

    1.2.5    神经细胞SOD和MDA的测定[8]:细胞经损伤处理后,去除原培养液,用PBS洗2遍,每孔加入0.1 mol·L-1PBS和0.05 mmol·L-1EDTA(pH 8.0)1 ml,再加入50 μl 1%Triton-X100,将24孔培养板置振荡器振荡1 min使细胞溶解,加入100 μl 25%H3PO4以沉淀蛋白,100 000×g于4℃离心1 h,取上清液,按试剂盒说明书测定SOD活力和MDA含量[9]。蛋白质定量用双缩脲法。

    1.3    数据处理方法    计量资料数据用x±s表示,统计处理用SPSS软件,行SNK-q检验

    2    结果

    形态学观察显示,大鼠前脑皮层神经细胞培养8~12 d后,胞体呈锥形或多极形,光晕明显,多聚集成团,细胞团之间可见粗大突起连接成神经网络,核不可见。经Glu损伤后,细胞突起缩短,胞体折光性下降,颗粒样物质增多。检测培养上清液,发现LDH漏出率、NO含量明显增加,而细胞匀浆中SOD含量显著降低,MDA含量则明显升高。Imi 10-5、10-6、10-7mol·L-1能显著减轻Glu对神经细胞的损伤作用,用药组与损伤组相比,细胞更接近正常形态,细胞存活率、细胞SOD含量增加,NO及MDA的生成均受到抑制。详见表1、2。


    表1    米帕明对Glu引起的神经(略)

    表2    米帕明对Glu损伤神经细胞(略)

    3    讨论

    Glu是中枢神经系统内含量最高的兴奋性氨基酸,在维持神经细胞正常信号传导中起着重要的作用。但Glu大量释放,激活Glu受体,继而引起一系列病理反应,导致神经细胞变性坏死。研究表明[9~11],脑缺血时细胞膜通透性增高,Glu释放增加、摄取减少,Glu浓度升高,过量Glu作用于NMDA受体使之门控的离子通道开放,引起K+大量外流,Ca2+、Na+、Cl-、H2O内流,胞内钙超载。细胞内Ca2+浓度升高是神经元损伤的机制之一,其后果是多方面的,除可激活一系列Ca依赖性酶,包括蛋白激酶C(PKC)、一氧化氮合酶(NOS)、核酸内切酶(endonuclease)、磷脂酶A2(PLA2)等,触发花生四烯酸代谢瀑布、黄嘌呤氧化酶系活化产生自由基,造成细胞损害外,尚可由激活NOS引起NO的继发性损伤。神经细胞和胶质细胞的细胞膜上存在谷氨酸/胱氨酸转运体(glutamate/cystine transporter,又称Xc antiporter system),其作用是将胞内Clu转运出胞,同时将胱氨酸胞外转运入胞。胱氨酸在胞内还原为半胱氨酸(Cys),后者是谷胱甘肽(GSH)的合成原料,也是其合成的限速因素。当细胞外Glu过多时可抑制谷氨酸/胱氨酸转运体的功能,使胱氨酸入胞减少,GSH合成减少。GSH是脑内重要的活性氧清除剂,故胞外Glu过多使细胞内氧自由基(OFR)堆积,从而对细胞产生毒性作用。OFR可以抑制Glu载体的功能,加剧胞外Glu堆积,增强Glu的毒性作用,使活性氧成分更趋增多,形成恶性循环。本实验显示,培养的神经细胞受到Glu损伤后,细胞死亡率、LDH漏出率升高,NO和膜脂质过氧化产物MDA生成增多,SOD活性下降。Imi能减少NO、MDA生成,降低LDH漏出率和细胞死亡率,提高SOD活性,表现出较强的脑保护作用。神经细胞缺血性损伤与Ca2+信号转导异常导致胞内Ca2+浓度升高密切相关,细胞Ca2+信号转导异常是神经细胞变性的“最后共同通道”。兴奋性氨基酸对神经细胞的损伤作用总是伴随着钙超载现象。因此我们认为Imi对Glu引起的大鼠神经细胞损伤的保护作用可能与其钙拮抗作用有关。

    参    考    文    献

    1. 宋秀媛,可君,张贵卿,等.米帕明对兔离体基底动脉的作用[J].中国药理学报,1992,13(5):457

    2. Dildy J,Leslie SW.Ethanol inhibits NMDA-induced increase in free intracellular Ca2+ in dissociated brain cells[J].Brain Res,1999,499:383

    3. Koh JY,Goldberg MP,Hartley DM,et al.Non-NMDA receptor mediated neurotoxicity in cortical culture[J].J Neurosci,1993,13(5):496

    4. Tamura Y,Sato Y,Yokota T,et al.If enprodil prevents glutamate cytotoxicity via polyamine modulatory sites of N-Methy1-D-Aspartate receptors in cultued cortical neurons[J].J Pharmacol Exp Ther,1993,265(2):1017

    5. 孙东旭,张莉,陈学清.体外细胞增殖和细胞毒试验.见:朱立平,陈学清主编.免疫学常用实验方法[M].北京:人民军医出版社,2000.191~208

    6. Kolh JY,Choi DW.Quantitative determination of glutamate mediated cortical neuronal injury in culture by lactate dehydrogenase efflux assay[J].J Neurosci Med,1987,5(5):83

    7. Keller JN,Kindy MS,Holtsberg FW,et al.Mitochondrial manganese superoxide dismutase prevents neural apoptosis and reduces ischemic brain injury:suppression of peroxynitrite production,lipid peroxidation,and mitochondrial dysfunction[J].Neurosci,1998,18(2):687

    8. Mizono Y.Changes in superoxide dismutase,catalase,glutathione peroxidase and  glutathionereductase activities and thiobarbituric acid reactive product levels in early stages of development in dystrophic chickens[J].Exp Neurol,1984,84(1):58

    9. Farrogui AA,Horrocks LA.Excitatory amio acid receptors,neural membrance phospholipid metobolism and neurological disorders[J].Brain Res Rev,1991,16:171

    10. Lafon M,Pletri S,Culcasi M,et al.NMDA-dependent superoxide production and neurotoxicity[J].Nature,1993,364:535

    11. Choi DW.Calcium:still center-stage in hypoxid-ischemic neuronal death[J].Trends Neurosci,1995,18:58

    1 滨州医学院药理学教研室    滨州市    256603; 2 郑州大学医学院药理学教研室

作者: 许勇 姬汴生 石乐鸣 刘红 张贵卿
医学百科App—中西医基础知识学习工具
  • 相关内容
  • 近期更新
  • 热文榜
  • 医学百科App—健康测试工具