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【摘要】 目的 探讨内皮细胞性一氧化氮合酶(eNOS)基因内含子4上ａ／ｂ基因的多态性与单纯2型糖尿病(NIDDM)及糖尿病并脑梗死(cerebral infarction,CI)的关系。方法 应用聚合酶链反应(PCR)技术，检测89例NIDDM合并CI病人的基因型，并与对照组比较。结果 NIDDM合并CI组eNOS基因ab基因型的频率(2697%)明显高于对照组(125%)及NIDDM组(1268%)，ａ等位基因的频率(1348%)也明显高于对照组(625%)及NIDDM组(634%)，均有显著性差异(Ｐ＜００５）。结论 eNOS基因ab基因型与NIDDM合并CI有相关性，等位基因a可能是NIDDM合并CI的危险因素。
【关键词】 一氧化氮合酶；基因多态性；脑梗死；糖尿病
【中图分类号】 Ｒ5871
Research about the a/b in intron 4 polymorphism of endothelial nitric oxide synthase(eNOS)
gene in type 2 diabetes with cerebral infarction
GE Ruli Ｃhen Fangmin ＨAN Xiaofeng et al
Ｄepartment of Neurology,Affiliated Hospital of Binzhou Medical College,Binzhou ２５６６０３
【Abstract】 Objective Ｔo investigate association between the a／ｂ in intron 4 polymorphism of endothelial nitric oxide synthase(eNOS) gene and type 2 diabetes with cerebral infarction(CI).Ｍethods Ｔhe genotype of 89 patients with type 2 disbetes with Cl and control group and type 2 diabetes group was measured by polymerase chain reaction (PCR).Ｒesults The ab genotype distibution frequency of eNOS gene in diabetes group with CI is higher than that in control group (26９７％vs１２５％）and type 2 diabetes (12６８％）.The a allele frequency of eNOS gene of diabetes group with CI is significantly higher than that in control group(13４８％vs６２５％),and significantly higher than that in type 2 diabetes (6３４％）,too.Statistical differences between diabetes group with CI and control group are significant (Ｐ＜００５），and between diabetes group with CI and diabetes group (P＜００５）．Ｃonclusion Ｔhere is association between ab genotype of eNOS and diabetes with CI.The eNOS ａ allele may be a risk factor for diabetes with CI.
【Ｋey words】 endothelial nitric oxide synthase,gene polymorphism,cerebral infarction,diabetes
近年来发现eNOS基因内含子4上ａ／ｂ基因是冠心病及糖尿病肾病(DN)的危险因子之一，但其与单纯2型糖尿病(NIDDM)的相关性不大。其与2型糖尿病并脑梗死(CI)有无相关性研究较少，本研究应用PCR技术对2型糖尿病并脑梗死患者进行eNOS基因内含子4上ａ／ｂ基因多态性的初步探讨，现将结果报告如下。
１ 临床资料
１．１ 一般资料
单纯NIDDM组71例，符合WHO的NIDDM诊断标准。排除心肌梗死及各类脑血管病。男42例，女29例，年龄45～８３岁，平均（633±１０２）岁。NIDDM＋ＣＩ组89例，男48例，女41例，年龄45～９５岁，平均（6505±１１１２）岁。来自2001—2002年青岛大学医学院附属医院神经内科住院患者，所有病人的诊断均符合中华医学会第4届全国脑血管病学术会议修订的诊断标准，均经头颅CT或MRI检查证实，排除脑出血，并排除有心肌梗死病史。对照组为随机挑选门诊健康查体者128例，男76例，女52例，年龄45～８８岁，平均（6207±１０９７）岁，经病史、体检、实验室检查、心电图检查，排除脑血管疾病、心肌梗死、肝肾功能不良。3组年龄、性别构成方面无显著差异。
12 方法
121 基因组DNA的提取：早晨空腹抽取检查对象外周静脉血05 ｍｌ，经EDTA抗凝，用基因组DNA快速提纯试剂盒(北京赛百盛公司提供)提取。
122 目的基因片段PCR扩增：引物参照Uwabo等［１］的设计，由北京赛百盛公司合成，序列为5ＧＧＧＡＡＣＣＴＣＡＧＣＣＣＡＧＴＡＧＴＧＡＡ３，５ＧＴＧＧＴＣＡＣＡＧＧＣＧＴＴＣＣＡＧＴＡＡＣ３。反应总体系50 μｌ，其中10×Ｂuffer 5 μｌ，dNTPs 1 μl,引物各5 μｌ，模板DNA 2 μｌ(约150 ｎｇ），Ｔａｑ酶15ｕ（０３ μｌ），甲酰胺1 μｌ，用水补齐至50 μｌ。反应条件：94℃预变性4 min，后进入循环，每个循环为94℃变性45 s，565℃退火45 s，延伸72℃ 45 s，35个循环后72℃延伸12 min终止反应。取3 μｌ PCR扩增产物在6%非变性聚丙烯酰胺凝胶上做垂直电泳，电压60 Ｖ，时间3 h，PCR Marker(华美公司提供)作参照，在05 μｇ／ｍｌ溴化乙锭染液中染色40 min后在紫外线灯下观察结果，并拍照。
１．２．３ ａ、ｂ等位基因的序列顺序由上海生物工程公司进行自动测序，进一步证实结果的确切性。
１．２．４ 统计学方法： 用SPSS统计软件进行统计学处理，计量资料组间比较用非配对的t检验，计数资料组间比较用χ２检验。
２ 结果
２．１ ａ、ｂ等位基因序列分析及测序见图1。eNOS基因内含子4上有两个等位基因和三种基因型在本组人群中被发现，两种等位基因一个是有4个27bp重复序列组成的417ｂｐ的PCR产物，由309ｂｐ侧翼序列和108ｂｐ的重复序列组成，一个是5个重复序列的444ｂｐ的PCR产物，由309ｂｐ侧翼序列和135ｂｐ的重复序列组成。三种基因型是ｂｂ，ａａ纯合子和ａｂ杂合子。测序结果也证实了27ｂｐ的重复序列单元与以前报道［２］的结果一致［５ＧＡＡＧＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＣ（Ａ／Ｇ）ＧＧＧＧＴＧＡＧ３］。５个重复的等位基因前三个重复第19个核苷酸是A，后两个重复序列是G；4个重复的等位基因前两个重复第19个核苷酸是A，后两个重复是G。
图1 PCR扩增产物（6%聚丙烯酰胺凝胶）(略)
２．２ 糖尿病合并脑梗死组与对照组的eNOS基因型表达及等位基因频率比较见表1。
对照组ａｂ基因型表达有16例，频率为125％；NIDDM组ａｂ基因型表达9例，频率为1268%，与对照组相比无显著性差异(Ｐ＝０９７)；ＮＩＤＤＭ＋ＣＩ组ａｂ基因型表达24例，频率为2697%，与对照组比较有显著性差异(P＜００１），与NIDDM组比较也有显著性差异(P＜００５)。在对照组测到ａａ基因型者1例，因理论频数太小，统计学处理时剔除。NIDDM组ａ等位基因频率为634%，对照组为625%，与对照组相比无显著性差异(P＝０９７)；NIDDM＋ＣＩ组ａ等位基因频率为1348%，显著高于对照组，有显著性差异(P＜００５），与NIDDM组比较也有显著性差异(P＜００５）。
表1 NIDDM合并CI组与对照组eNOS基因型及等位基因频率分布（略）
3 讨论
2型糖尿病是一种有环境因素参与的多基因遗传病，脑梗死也是环境和遗传因素共同作用的结果。目前，对环境因素已经有了很深的认识，但是遗传易感性的分子基础还有许多不清楚，遗传因素的影响可能单独起作用或通过易感或调节已知的危险因素如高血压而起作用。
目前，已知一氧化氮(NO)是由精氨酸和分子氧在3种不同的NOS催化下生成的，NOS至少有3种同工酶，分别为神经元型NOS(nNOS)，诱导型NOS(iNOS)和内皮细胞型NOS（eNOS)。来源不同类型的NOS的NO作用不同，有的起保护作用，有的起神经毒性作用。ｅＮＯＳ主要存在于血管内皮细胞中，还存在于神经组织和血小板中，与心脑血管疾病发生关系密切。它可被多种介质激活后导致NO在内皮细胞中增加，NO进入临近平滑肌细胞，通过NOＧＣｃＧＭＰ途径产生肌肉舒张、血管扩张和脑血流量增加。NO还减少血小板的粘附和白细胞的聚集，抑制血管平滑肌细胞增生，防止低密度脂蛋白氧化以及抑制血管收缩因子内皮素及血管紧张素的作用，因此具有抗血管早期动脉粥样硬化作用［２，３］。意大利的研究人员检测了处于胰岛素和(或)高糖(25 ｍｍｏｌ／Ｌ）环境培养24 ｈ的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中，eNOS基因表达及一氧化氮残生的情况。发现与对照相比，胰岛素可使HUVECs细胞eNOS基因表达明显升高，而高糖则明显削弱此效应。另外，胰岛素可使NOS活性明显升高，而高糖环境下胰岛素的作用亦明显降低。因此，研究认为高浓度葡萄糖可以削弱胰岛素对内皮细胞NO合成的促进作用。
eNOS基因位于第7号染色体长臂(7ｑ３６），含有26个外显子和25个内含子，总长21 kb，编码为含有1203个氨基酸的蛋白质。eNOS基因多态性与冠心病、心肌梗死、高血压、动脉粥样硬化的关系得到了肯定，但研究结果也不一致。eNOS与心血管疾病及动脉粥样硬化的研究为其与脑血管疾病关系的研究提供了基础。eNOS基因存在多个与心脑血管疾病相关的基因多态性位点，目前对7号外显子处G849→T突变，启动子区T786→C突变的研究较多。自从Wang等［４］报道了eNOS基因第4号内含子27ｂｐ的VNTR多态性与血浆NOｘ密切相关之后，eNOS第4号内含子处27ｂｐ的VNTR的研究倍受瞩目。李长贵等［５］对228例中国人该基因多态性与糖尿病及糖尿病肾病的关系进行研究后认为，该基因多态性是糖尿病肾病的遗传危险因素。Yahashi等［６］对218例日本人该基因多态性与缺血性卒中的关系进行研究后认为，在日本人中该基因多态性并不是缺血性脑血管疾病的遗传危险因素。2001年，Hｏｕ等［７］对880例中国人的研究显示，eNOS等位基因ａ在缺血性卒中与对照组中的频率差异显著(17%∶７８％；ＯＲ ２４４；Ｐ＜０００５），证实了eNOS第4号内含子基因多态性可能是中国人患缺血性脑血管疾病的独立危险因素，特别在无常见危险因素的缺血性脑血管患者中尤为显著。
本研究发现在NIDDM组aｂ基因型及ａ等位基因的频率较对照组无明显增高，无显著性差异(P＞００５）；与李长贵等报告结果一致。而NIDDM合并CI组ａｂ基因型的分布频率(2697%)较对照组(125%)明显增高，有显著性差异(P＜００１），ａ等位基因的频率在NIDDM合并CI组也明显高于对照组(1348%∶６２５％），也有显著性差异(P＜００５），与NIDDM组比较ａｂ基因型的分布频率(2697%∶１２６８％）及ａ等位基因的频率(13４８％∶６３４％)均有显著性差异(Ｐ＜００５）。虽然eNOS基因多态性在CI的发病机制中的作用尚不十分清楚，但NO在内皮细胞上的作用已十分清楚，内皮性NO对内皮细胞有保护作用，若血管内皮性NO系统活性下降可导致eNOS基因产物量下降，而引起心脑血管疾病。在糖尿病患者，可通过高浓度葡萄糖削弱了胰岛素对内皮细胞NO合成的促进作用，使血管内皮性NO系统活性下降而导致ｅＮＯＳ基因产物量下降，引起脑梗死。因此，可以认为NIDDM合并CI与eNOS基因内含子4上ａ／ｂ基因相关性假设是合理的，可能是因为eNOS基因表达的产物量的改变而导致发生CI的敏感性增高有关。总之，本研究结果显示出在糖尿病患者中eNOS基因ａ／ｂ多态性与CI有相关性，ａｂ基因型可能是糖尿病合并CI发病的危险因素。
参 考 文 献
１． Uwabo J,Soma M,Nakayama T，et al．Ａssociation of a variable number of tamden repeats in the endothelial constitutive nitric oxide synthase gene with essential hypertension in Japanese［Ｊ］．Ａm J Hypertension,1998,11∶１２５
２． Ｌembo G,de Luca N,Battagli C,et al.A common variant of endothelial nitric oxide synthase (Glu298Asp) is an independent risk factor for carotid atherosclerosis［Ｊ］．Ｓtroke,2001,32:735
３． Ｍarkus HS,Ruigrok Y,Ali N,et al.Endothelial nitric oxide synthase exon 7 polymorphism,ischemic cerebrovascular disease,and carotid atheroma［Ｊ］.Stroke,1998,29:1908
４． Ｗang XL,Mahaney MC,Sim AS,et al．Ｇenetic contribution of the endothelial constitutive nitric oxide synthase gene to plasma nitric oxide level.Arterioscler Thromb Vasc Biol,1997,17:3147
５． 李长贵，董砚虎，吕文山，等.内皮细胞型一氧化氮合酶基因多态性与糖尿病肾病的相关性研究［Ｊ］.中华内科杂志，2001，40：729
６．Ｙahashi Y,Kario K,Shimada K,et al.The 27ｂｐ repeat polymorphism in intron 4 of the endothelial cell nitric oxide synthase gene and ischemic stroke in a Japanese population.Blood Coagul Fibrinolysis,1998,9:405
７． Ｈou L,Osei Hyiaaman D,Yu H,et al.Association of a 27ｂｐ ｒｅｐｅａｔ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎ ｅｃＮＯＳ ｇｅｎｅ ｗｉｔｈ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｓｔｒｏｋｅ ｉｎ Cｈｉｎｅｓｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２００１，５６：４９０
滨州医学院附属医院神经内科 滨州市 256603
（收稿日期：2005０４０５）