PC12细胞缺糖损伤的分子生物学特征

　　【摘要】  目的  在体外模拟能量代谢障碍研究PC12细胞缺糖损伤的分子生物学特征。方法  电镜观测形态改变，MTT检测功能异常，RTＰＣＲ测定Bcl２在RNA水平上的表达。结果  电镜观察到细胞有凋亡现象；MTT显示细胞活力降低；RTＰＣＲ结果表明Bcl２在6~１６ h表达上调。结论  缺糖损伤的PC12细胞既有形态的变化也有功能上的变化，并同时伴随着凋亡和坏死两种死亡现象。

　　【关键词】  PC12细胞；缺糖损伤；凋亡

　　Ｃellular and molecular alterations of PC12 cells deprived of glucose

　　ＳONG Xiaodong  ＪＩＡＮＧ　Shaofeng  ＮＩＵ　Ｘinhua  et al

　　Ｄepartment of Biology,Binzhou Medical College,Binzhou  256603

　　【Abstract】  Ｏbjective  Ｂy using glucose deprivation (an insult relevant to the brain ischemia) media,PC12 cell strain was evaluated.Ｍethods  Ｂy cellular and molecular biological techniques including electron microscopy,MTT,and RTＰＣＲ to meaure and observe.Ｒesults  Electron microscopy reveals the treated PC12 cells underwent apoptosis;MTT result shows the treated PC12 cells viabilities induced;Bcl２ RNA levels expressed to peak levels 6１６ hours after glucose deprivation treatment and then declined gradually.Ｃonclusion  The PC12 cells deprived of glucose underwent the morphological and functional alterations including apoptosis and necrosis.

　　【Key words】  ＰＣ１２ cell，glucose deprivation,apoptosis

    许多临床和实验研究发现脑缺血的时间和程度与脑功能损害程度成正相关［１］，这是神经细胞对缺血的耐受力差造成的［２］，因此认为研究缺血对神经细胞的损伤机制是研究缺血性脑损害的核心［３］。本文采用PC12细胞，运用无糖培养模拟体外细胞能量代谢障碍的方法，通过电镜观测、MTT检测、RTPCR等方法分析了PC１２细胞在无糖培养的不同时间段细胞的变化。

　　１  材料与方法

　　１．１  材料
 
　　PC12细胞购自中科院上海细胞所，DMEM高糖培养液购自GiBco公司，噻唑蓝(MTT)购自Sigma公司，RTＰＣＲ引物由上海生工生物技术有限公司合成：βactina 5'AACCGTGAAAAGATGACCCAG３',５'ＣＴＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＡＴ３';Bcl２　５′ＣＡＣＣＣＣＴＧＧＣＡＴＣＴＴＣＴＣＣＴ３′，５′ＧＴＴＧＡＣＧＣＴＣＣＣＣＡＣＡＣＡＣＡ３′，Eagle Eye Ⅱ凝胶成像分析仪美国Stratagene公司生产，FR９００ DNA热循环仪购自上海复日生物实验技术研制所。

　　１．２  方法

　　１．２．１  ＰＣ１２细胞对照组及缺糖实验组的建立：PC12细胞接种于培养瓶内，加入含10%胎牛血清、5%马血清的DMEM细胞培养液3 ml，每2~３ d更换一次培养液，待培养形成的细胞汇合成单层细胞以后，用025%胰蛋白酶消化传代或接种于培养板上，保持细胞状态良好以备实验使用。
ＰＣ１２细胞先以有糖DMEM培养液培养于25 ml培养瓶内，待细胞生长至铺满瓶壁后换入10%胎牛血清、5%马血清的DMEM无糖细胞培养液3 ml，无糖培养时间根据不同需要选取不同时间段。

　　122  电镜观察细胞形态变化：取实验组对照组细胞，放入15 ml Ep管，4000 r/min 5min，弃上清，沉淀用PBS混匀，4000 r/ min 5min。如此重复三次后得细胞沉淀块进行如下操作：①固定：戊二醛2 h，PBS冲洗5 min 3次，锇酸2 h，PBS冲洗5 min 3次。②脱水：50%乙醇15 min，70%乙醇15 min，90%乙醇15 min，90%乙醇与90%丙酮(1∶１）15 min，90%丙酮15 min，100%丙酮15 min 3次。③浸透：100%丙酮＋包埋液(1∶1)4 h，包埋液2 h。④环氧树脂618包埋。⑤固化：37℃ 12 h、４５℃ 12 h、６０℃ 24 h。⑥超薄切片：修理细胞块后在LKB超薄切片机上用玻璃刀切片，厚度为5～１０ nm。⑦染色：醋酸铀30 min，枸杞酸铅10 min。⑧电镜下观察细胞形态。

　　１．２．３  MTT比色法检测细胞活力：选取实验组对照组各6孔，实验组缺糖时间分别是1、３、９、２４、４８ h。每孔加15　μl MTT溶液，放入37℃５％ＣＯ２培养箱中培养4 h。100 μl异丙醇终止，室温30 min。酶标仪570 nm处测定OD值。

　　１．２．４  反转录聚合酶链式反应(reverse transcriptionpolymerase chain reaction,RTＰＣＲ)：选取实验组对照组细胞，将培养皿中的培养液彻底弃干净，加入1 ml RNAexReagent,将细胞并RNAexReagent一起移入15 ml离心管中。室温静置5 min，再加入200　μl氯仿，用力颠倒离心管以混匀。静置5 min后，12 000 r/min高速离心10 min。小心将上层水相移至15 ml离心管中，加入500 μl异丙醇，振荡混匀，室温静置8 min。高速离心5 min，小心弃上清。加入1 ml 75%乙醇，振荡片刻，7500 r/min离心5 min,小心弃上清。室温静置12 min使RNA沉淀恰好干燥，加入水溶解RNA。720分光光度计上测260 nm、２８０ nm的OD值，计算RNA的浓度。取等量RNA、OligdT、ＤＥＰＣ水共13 μ1。７０℃加热8 min，立即将微量离心管冰浴至少1 min，然后加入下列试剂：5×buffer 5 μl，dNTPs5 μl，ＭＭＬＶＲＴ　１ μl，Ｒasin 1μl，轻轻混匀，放入37℃恒温水浴锅中60 min。90℃，2～３ min。50　μl反应体系：灭菌三蒸水34 μl，引物1 1 μl，引物2 1 μl,10×buffer(MgCl２ ２5 mM)5 μl,dNTPs 5 μl,Taq酶1 μl,cDNA 3 μl,混匀，7500 r/min离心30 s，石蜡油覆盖。PCR循环参数设置：预变性94℃ 350 s，变性94℃ ６０ s，退火60℃ 60 s，延伸72℃ 60 s，再延伸72℃ 300 s，共35个循环。15%琼脂糖凝胶检测PCR扩增产物，Eagleeye凝胶成像分析仪检测。

　　２  结果

　　２．１  电镜观察结果 

　　培养于DMEM完全培养基中的PC12细胞，细胞形态清晰，结构完整，细胞膜及核膜结构完整，界线清晰，有伪足(图1，7500倍)。培养于无糖培养液中24 h的PC12细胞，可见细胞膜发生皱缩、凹陷，染色质浓缩，聚集于不完整的核膜边缘，呈蝇眼状，核膜不完整，界线模糊(图2，7500倍)。

　　２．２  MTT检测结果 

　　MTT是一种淡黄色的唑氮盐，为线粒体脱氢酶的底物，活细胞能将其还原成不溶于水的黑色结晶，结晶溶解于酸性异丙醇后通过测其OD值，可反映出活细胞数。(0为DMEM完全培养基培养的对照组细胞的MTT值，1、3、9、24、48分别为无糖培养1、3、9、24、48 h的PC12细胞的MTT值)。从图3看到随着无糖培养PC12细胞时间的延长，MTT值逐渐降低，在24 h左右其MTT值降低最明显，说明PC12细胞的存活率随着缺糖时间的延长而降低，在24 h左右变化最明显。实验组和对照组进行t检验，P＜001。

　　２．３  RTＰＣＲ结果 

　　Bcl２基因(图4前面的条带，大小为349 bp)经PCR扩增后，15%的琼脂糖凝胶上电泳，在Eagle Eye Ⅱ 凝胶成像分析仪上可以看到图4的条带。为使实验有一定的可比性，设置内参βactina(图4后面的条带，大小为741 bp)，其中对照组亮度明显低于无糖培养6 h，12 h及24 h的亮度，灰度比值最小，12 h的灰度比值最大，提示无糖培养24 h里Bcl２基因先是上调表达，此后表达下调。Image软件测量以上各条带的灰度，结果如表1（P＜005）。表1  bcl２基因和βactina基因的灰度值及灰度比值 （略）

　　3  讨论

　　脑缺血是一类发生率很高的脑血管疾病，建立合适的缺血模型探讨缺血后各种因素引起的神经细胞的损伤机制有着重要的价值［４］。细胞培养由于能够在条件相对恒定的培养箱中培养，受外界影响较小，又容易对各个因素分别予以添补或去除，成为一种重要的损伤模型。

　　本文选择大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(rat adrenal pheochromocytoma,PC12)细胞，运用无糖培养基，在体外模拟能量代谢障碍［５］研究PC12细胞缺糖损伤的分子生物学特征。结果显示，无糖处理后，细胞活力下降，电镜下可观察到典型的细胞凋亡特征。本文研究者还曾用流式细胞仪检测到细胞凋亡和坏死同时并存，24 h左右细胞凋亡达到最大。RTＰＣＲ方法检测了抑制细胞凋亡的基因Bcl２的表达，实验显示6~１６ h时Bcl２表达量显著增高，此后表达量慢慢下降。本文为研究神经细胞损伤的分子机制奠定了基础，提供了研究脑缺血模型的科学数据。

　　参  考  文  献

　　１．　Mattson MP.Presenilin１　mutation increases neuronal vulnerability to focal ischemia in vivo and to hypoxia and glocuse deprivation in cell culture:involvement of perturbed calcium homeostasis［Ｊ］．Ｊ　Ｎeurosci,2000，20：1358

　　２．　Ｅscuret E.［Cerebral ischemic cascade］ To:cascade ischemique cerebrale［Ｊ］．Ann Fr Anesth Reanim,1995,14(1):103

　　３．　Plaschke K,Yun SW,Martin E,et al．Ｌinear relation between cerebral phosphocreatine concentration and memory capacities during permanent brain vessel occlusions in rats［Ｊ］．Ａnn n Y Acad Sci,2000,903:299

　　４．　ＡlＡbdulla NA,Martin LJ.Apoptosis of retrogradely degenerating neurons occurs in association with the accumulation of perikaryal mitochondria and oxidative damage to the nucleus［Ｊ］．Ａm J Pathol,1998,153(2):447

　　５．　Ａstren E,Ohga Y,Berzaghi MP,et al．Ｂcl２ messenger RNA is localized in neurons of the developing and adult rat brain［Ｊ］．Ｎeuroscience,1994,61:165

　　1 滨州医学院生物学教研室  滨州市  256603；2 复旦大学医学院  上海市  230002

　　(收稿日期：2005０５１２）