子宫内膜癌中VEGFC 及其受体mRNA的表达及临床意义

   【摘要】  目的  研究子宫内膜癌组织中血管内皮生长因子C及其受体mRNA的表达情况，分析其在肿瘤转移中的作用。方法  采用RTPCR法分析48例新鲜子宫内膜癌组织标本中VEGFC/KDR/ Flt4mRNA的表达情况，并分析其与各临床病理参数之间的关系。结果  48例子宫内膜癌组织中的VEGFC及其受体mRNA表达率明显高于正常子宫内膜组织，肿瘤组织中VEGFCmRNA表达与Flt4mRNA的表达呈显著正相关。结论  VEGFC可能在子宫内膜癌转移尤其是淋巴转移中起重要作用，是一个反映病人淋巴转移和预后的良好指标。

    【关键词】  血管内皮生长因子C；血管内皮生长因子受体 ；淋巴转移； 子宫内膜肿瘤

     Clinicopathological significance  of vascular endothelial growth factor C and its receptors in endometrial  adenocarcinoma

    ZHANG Hong

    Central Hospital of Zibo，Zibo 255036

    【Abstract】  Objective  To investigate the expression of vascular endothelial growth factorC(VEGFC) and its receptor  in endometrial adenocarcinoma tissue in pursuit of their role in tumor metastasis and other clinical significance.Methods  48 fresh endometrial adenocarcinoma tissue were examined by RTPCR to detect the VEGFC/KDR /Flt4mRNA expression.Results  There was a significant difference of VEGFC/KDR /Flt4mRNA  expression between the tumor and the normal controls. And there was no significant relationship between VEGFC mRNA, KDR mRNA or flt4mRNA expression with the pathological types and clinical stage of invasive carcinoma of cervix. But the expression was significant association with  the grade of tumor pathology, lymph node metastasis, tumor size and the  invasion of deep muscular layer(P<005).Conclusion  The results suggest that the VEGFC may play an important role in the lymph node metastasis and it could be a useful biological marker to foresee the lymph node metastasis and prognosis for cervical cancer.

    【Key words】  vascular endothelial growth factor C(VEGFC)，vascular endothelial growth factor receptor，lymphatic  metastasis，cervical neoplasm

    子宫内膜癌是严重威胁妇女生命的第三大恶性肿瘤，发病率呈升高和低龄化趋势。目前子宫内膜癌的发病原因及机制尚未完全阐明，诊断治疗上还有许多问题没有解决。其发生远处转移是造成子宫内膜癌治疗困难的原因之一，多数学者认为淋巴结转移对子宫内膜癌的预后至关重要，是判断患者预后和确定治疗方案的重要依据。目前的仪器检查很难较早发现淋巴结转移，淋巴结转移是子宫内膜癌治疗的难点之一，而对其淋巴道转移机制的深入研究将有助于新的有效的治疗手段的发展。由于缺乏明确的淋巴管生成因子和标记因子，对淋巴转移的研究进展缓慢。血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor C，VEGFC)是迄今为止发现的唯一的淋巴血管内皮细胞刺激因子［1］，其通过其受体VEGFR2（KDR）及受体VEGFR3（Flt4）分别作用于血管和淋巴管上皮促进肿瘤的生长和转移。本研究通过逆转录聚合酶链反应（RTPCR）检测了VEGFC及其受体2、3mRNA在子宫内膜癌组织中的表达，并探讨其在肿瘤转移中的作用。

    1  资料与方法

    1.1  研究对象  48例子宫内膜癌组织和36例正常子宫内膜组织均来自2003年1月-2004年12月我院妇科手术切除标本，均经病理证实。患者年龄32~71岁，中位年龄52.2岁。按FIGO标准分期，Ⅰb2期15例，Ⅱa期20例，Ⅱb期13例； 按WHO组织学类型分型：腺癌12例，鳞癌32例，腺鳞癌4例；病理分化程度：高分化6例，中分化22例，低分化20例。术后证实无淋巴结转移19例，淋巴结转移29例。肿瘤直径＜4 cm 28例，肿瘤直径≥4 cm 20例。癌组织局限于浅肌层以内27例，有深肌层浸润者21例。所有病例术前均未经任何治疗，临床资料完整。

    1.2  标本采集  手术切除的子宫内膜癌标本离体后，立即于无菌状态下沿肿瘤边缘切取生长活跃的瘤组织，将所取组织切成3~5 mm的组织小碎块装入冻存管内并立即放入液氮中，随后将其转入-70℃冰箱内保存。采用同样的方法切取和保存作为对照的正常子宫内膜组织，对照标本均取自子宫肌瘤行全子宫切除的患者。

    1.3  方法

    1.3.1  RNA的提取及检测：总RNA提取用TRIzol试剂一步法。

    1.3.2  多重RTPCR：所用的引物和内参照β2微球蛋白（β2MG）引物均委托上海生工公司合成，VEGFC、KDR所用引物序列参照了以前研究者的设计［2］ 。根据VEGFC及KDR引物Tm值，DNAstar软件设计了Flt4的引物序列（见表1）。表1  引物序列引物序列Tm值片段 163根据QIAGEN OneStep RTPCR Kit的说明，在同一反应体系中同时扩增β2MG、VEGFC、KDR及Flt4的4对引物，为去除多重PCR反应中的扩增竞争，较为准确地获得不同靶基因的扩增结果，体系中使用QIAGEN OneStep RTPCR Kit试剂盒提供的Q溶液。根据紫外分光光度仪检测的OD值计算RNA样品浓度，将RNA样品稀释，以保证RTPCR体系中RNA模板加样4 μl时，所加的模板含量基本一致，即首先做到模板定量。具体PCR循环参数为：变性94℃ 60 s，退火52℃ 60 s，延伸72℃ 90 s，共35个循环。最后延伸72℃ 10 min以获得更多的扩增产物。

    1.3.3  扩增产物半定量分析：PCR反应扩增产物4 μl加4 μl载样缓冲液加15 μl溴酚兰，以05×TBE为电泳缓冲液，在2%琼脂糖凝胶上80 V恒压电泳40 min。将电泳结果用凝胶成像仪扫描记录并借助凝胶图像分析系统（BioCapT V.10）测定灰度。以VEGFC、 KDR、flt4和βactin条带灰度值之比作为相对光密度。

    13.4  统计学处理：用SSPS统计软件（11.0版本）进行，所用的统计学方法为卡方检验，P＜005认为有统计学意义。

    2 结果

    2.1  VEGFC及其受体mRNA在肿瘤组织（T）及正常子宫内膜组织（N）中的表达  VEGFC阳性者可见320 bp条带，flt4阳性者可见402 bp条带， KDR阳性者可见555 bp条带 (见图1)。各项指标在肿瘤组织中的表达率均明显高于正常子宫内膜组织，其具体表达率见表2。图1  子宫内膜癌组织中VEGFC及其受体KDR、Flt4 mRNA的表达。表2  VEGFC 及其受体mRNA在不同组织中的表达

    2.2  肿瘤组织（T）中VEGFC及其受体mRNA表达的相关性(见表3)  在肿瘤组织中VEGFC mRNA表达与Flt4 mRNA的表达有显著的相关性，但与KDR mRNA的表达无明显的相关性。表3  肿瘤组织中VEGFC及其受体mRNA表达的相关性受体统计结果显示，肿瘤组织中VEGFC mRNA及其受体mRNA表达与肿瘤的病理类型及临床分期无明显的相关性；而与肿瘤的病理分化程度、淋巴结转移、肿瘤直径、深肌层浸润有明显的相关性(P<005)。

    3  讨论

　子宫内膜癌的临床特点是局部蔓延，肿瘤细胞主要通过淋巴途径转移，沿着组织间隙直接向子宫内膜或宫体以外扩展，临床多以有无淋巴结转移来评估预后及指导治疗，因而早期预测和发现有无淋巴结转移具有重要临床意义。近来研究发现血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor C，VEGFC)基因位于染色体4q34上，是一个较为特异的淋巴内皮细胞生长刺激因子，由于其可以特异性地和淋巴管内皮细胞上分布的Flt4受体结合，在体内和体外都有促淋巴管生成作用，是目前所知具有最强淋巴管生成作用的因子。VEGFC具有促血管生成和促淋巴管生成的双重生理作用。VEGFC在淋巴管丰富的区域有明显的表达，与Flt4的表达范围相似。近来研究显示，多种恶性肿瘤中VEGFC及其受体的表达升高，并且和肿瘤的淋巴转移呈正相关［3，4］。本研究结果显示子宫内膜癌组织中的VEGFC及其受体mRNA表达率明显高于正常子宫内膜组织，但子宫内膜癌组织中的VEGFC及其受体mRNA表达无明显差异。提示VEGFC在子宫内膜癌的发生、发展中起重要作用。VEGFC通过位于细胞表面的酪氨酸激酶类受体KDR及Flt4发挥作用。VEGFC与不同的受体结合的生物学效应不同。研究结果显示在肿瘤组织中VEGFC mRNA表达与Flt4 mRNA的表达有着密切的相关 性，与KDR mRNA的表达无明显的相关性，表明肿瘤组织中VEGFC与主要存在于淋巴管内皮细胞表面的Flt4结合，而发挥促淋巴管生成的作用。VEGFC可促进肿瘤淋巴管生成及肿瘤细胞向区域淋巴结转移，可以认为VEGFC在淋巴增生与实体瘤的扩散中起重要作用。Karpanen等［5］ 将过表达重组VEGFC的MCF7人类乳腺癌细胞原位移植入严重联合免疫缺陷小鼠，VEGFC通过结合Flt4显著地促进肿瘤周围肿瘤相关淋巴管的生长，这些位于肿瘤周围的淋巴管经常被肿瘤细胞浸润，但对血管生成的作用不明显，阻断Flt4可抑制这些现象。Kitadai等［4］采用PTPCR法研究发现食管鳞癌组织中Flt4 mRNA的表达升高，且与VEGFC mRNA表达水平有相关性，与我们的研究结果一致。VEGFC可增加血管渗透性，并刺激内皮细胞的迁移和增生， VEGFC的血管效应主要通过KDR介导。VEGFC与Flt4结合的亲和力高于KDR，VEGFC与Flt4结合后可以调节KDR的信号通路。因此我们认为肿瘤的淋巴转移过程中VEGFC/Flt4途径起着十分重要的作用。VEGFC还可通过受体KDR和/或Flt4诱导肿瘤血管生成，从而促进肿瘤生长及转移。这些过程可通过自分泌和旁分泌两种方式进行。总之，子宫内膜癌细胞分泌VEGFC，通过其自身及分布在外周血管及淋巴内皮细胞上的特异性受体，促进子宫内膜癌的淋巴及血行转移，从而影响患者的预后。而我们的研究提示VEGFC及其受体是一个反映病人淋巴转移和预后的良好指标，有望成为子宫内膜癌治疗的新靶点。抑制其表达或同时阻断其效应是目前国内外抗血管生成治疗肿瘤的热点，将为肿瘤的临床治疗探索一条新的途径。

    参  考  文  献

    1Kark kainen MJ,Petrova TV .Vascular endothelial growth factor receptors in the regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis［J］.Oncogene ,2000,19(49):5598

    2Ohta Y,Shridhar V,Bright PK,et al.VEGF and VEGFC play an important role in angiogenesis and lymphangiogenesis in human malignant mesothelioma tumours［J］. Br J Cancer，1999，81(1):54

    3Onogawa S,Kitadai Y,Tanaka S,et al.Expression of VEGFC and VEGFD at the invasive edge correlate with lymph node metastasis and prognosis of patients with colorectal carcinoma［J］. Cancer Sci,2004,95(1):32

    4Kitadai Y，Amioka T，Haruma K，et al. Clinicopathological significance of VEGFC in human esophageal squamous cell carcinoma［J］.Int J Cancer，2001，93(5):662

    5Karpanen T，Egeblad N，Karkkainen MJ，et al.Vascular endothelial growth factor  C promotes tumor lymphangiogenesis and  intralymphatic tumor growth［J］.Cancer Research，2001，61(5):1786

    淄博市中心医院妇产科  淄博市  255036