川芎嗪对缺氧缺血性脑损伤炎症细胞因子作用的实验研究

【摘要】  目的 观察川芎嗪对新生鼠脑组织缺氧缺血性脑损伤（HIBD）后炎症细胞因子IL8、TNFα、IL10动态变化的影响。方法 选用7日龄Wistar大鼠90只，随机分为假手术对照组、HIBD组、川芎嗪治疗组，检测0~48 h 5个不同时间点的效应指标的变化趋势及组间差异。结果 HIBD组各时间点IL8、TNFα、IL10浓度均比假手术对照组明显升高(P ＜001)，川芎嗪治疗组IL8、TNFα、IL10浓度均比HIBD组降低。结论 缺氧缺血早期促炎症细胞因子IL8、TNFα和抑炎症细胞因子 IL10表达上升，川芎嗪可减轻缺氧缺血脑损伤后新生鼠脑内炎症程度。

【关键词】  川芎嗪；缺氧缺血性脑损伤；白细胞介素8；肿瘤坏死因子α；白细胞介素10

　　Research of ligustrazine on brain tissue proinflammatory cytokine in rats after hypoxicischemic brain damage

　　WU Honghua1  YANG Cheng1  SHI Zengli2   et al

　　1 Department of Anatomy, Binzhou Medical University, Binzhou  256603; 2Department of Pathophysiology ，Binzhou Medical University

　　【Abstract】  Objective  To study the effects of ligustrazine on the expression of IL8，TNFα and IL10 after hypoxicischemic brain damage in rats' brain tissue.Methods  Ninety Wistar rats of 7dayold were randomly divided into experiment group and control group. The enzymelinked immunosorbent assay was used to measure mean concentrations of IL8，TNFα，IL10 in rats' brain tissue after the model of HIBD was established. Results  The mean concentrations of IL8，TNFα，IL10 in HIBD group were significant higher than those in sham operated group (P＜001).In ligustrazine intervention group, compared with HIBD group, the concentrations were decreased.Conclusion  The concentrations of IL8,TNFα and IL10 were increased after HIBD, ligustrazine could regulate down the inflammation degree,which might be one of mechanisms of ligustrazine treating HIBD.

　　【Key words】  ligustrazine, hypoxicischemic brain damage,interleukin8,tumor necrosis factor alpha，interleukin10   
　　缺氧缺血性脑损伤（hypoxicischemic brain damage, HIBD）是导致新生儿神经功能障碍和智力低下的一个重要原因，近年来炎性细胞因子的作用在HIBD的研究中越来越受到重视。研究表明，中药川芎嗪(ligustrazine)具有抗炎作用［１］，在临床上对缺氧缺血脑损伤有保护作用。 IL8、TNFα是重要的促炎症因子，IL10是重要的抑炎症因子，三者在HIBD外周血中变化有较多报道，但脑组织内的变化研究尚少。本实验采用酶联免疫吸附测定法（enzymelinked immunosorbent assay ,ELISA）检测，应用川芎嗪治疗Wistar新生大鼠HIBD后脑内炎症细胞因子IL8、TNFα、 IL10动态变化，探讨川芎嗪在HIBD中的脑保护作用。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验动物及分组  选用新生7日龄Wistar大鼠90只，体重（15±3.5）g，随机分为假手术对照组、HIBD组、川芎嗪治疗组，每组30只。每组再随机分为分0、6、12、24、48 h五个时间点组，每时间点组6只。

　　1.2  动物模型制备  参照Rice等法［2］。乙醚麻醉，取仰卧位，颈前正中切口，分离并结扎右侧颈总动脉，缝合皮肤。半小时后放入缺氧瓶中，通8%O2/92%N2混和气体2 h，温度（36.5±0.5）℃。模型成功后将实验大鼠再随机分为HIBD组、川芎嗪组。假手术对照组（以下称对照组）分离右侧颈总动脉，不结扎。川芎嗪组按30 mg/kg剂量腹腔注射川芎嗪，HIBD组给相应量生理盐水。模型完成后即刻、12 h各注射1次，此时开始计时，时间点为0 h。

　　1.3  主要仪器和药品  高速低温离心机（德国 Heraeus公司），全自动酶标仪 （美国 Multiskan M.S），盐酸川芎嗪注射液（北京永康药业有限公司，产品批号041213），原装进口大鼠IL8 ELISA试剂盒（美国 Rapidbio公司），原装进口大鼠TNFα、IL10 ELISA试剂盒（美国Biosource公司）。

　　1.4  取材及标本检测  各组分别于0、6、12、24、48 h，左心室生理盐水灌注冲洗，取右脑称重，液氮保存。标本与生理盐水1∶2（w/v），匀浆，4 ℃离心12 000 r/min,15 min，取上清，每管平均分为三份。ELISA法检测IL8、 TNFα、IL10浓度，参照说明书步骤操作。

　　1.5  统计分析  采用SAS统计软件包处理。对实验组与对照组之间的效应差异应用方差分析和t检验进行统计比较。以α=0.05作为判断差异显著性的标准。

　　2  结果

　　2.1  分组情况  本实验动物随机分组，各组体重组间比较无明显差别（P>0.05），方差齐。各时间点IL8的浓度HIBD组中最高，川芎嗪治疗后降低，对照组最低。HIBD组和川芎嗪组IL8浓度随时间延长均逐渐上升，24 h达到高峰后开始回落。经t检验表明各时间点HIBD组与对照组间IL8的浓度变化均有明显的统计学意义（P<0.01）。HIBD组和川芎嗪组IL8浓度在各个时间点P＜0.01，0 h时t值最大，t=7.02。详见表1。
　　
　　表1  大鼠脑匀浆IL8含量动态变化 （略）
　　
　　2.2  各时间点TNFα浓度比较  川芎嗪组低于HIBD组，对照组最低。经t检验表明各时间点HIBD组与对照组间TNFα的浓度比较，变化均有统计学意义（P<001）。HIBD组和川芎嗪组TNFα浓度随时间延长逐渐上升，12 h时均达最高值后回落。两组TNFα浓度变化的比较在0 h时P=0103,其余各时间点P＜001。24 h时t值最大，t=2804。详见表2。
　　
　　表2  大鼠脑匀浆TNFα含量动态变化比较（略）
　　
　　2.3  各时间点IL10浓度比较  HIBD组较对照组明显升高，川芎嗪治疗后降低。随时间延长三组IL10浓度逐渐上升。t检验表明HIBD组与对照组间IL10的浓度变化在各时间点均有明显的统计学意义（P<001）；川芎嗪组同HIBD比较各时间点IL10的浓度变化均有明显的统计学意义（P<001）。6 h时t值最大，t=1137。详见表3。
　　
　　表3  大鼠脑匀浆IL10含量动态变化比较（略）
　　
　　3  讨论
　　
　　研究认为，缺氧缺血性脑损伤中能量代谢障碍、兴奋性氨基酸毒性、自由基的损伤、钙超载、细胞凋亡及相互影响在其病理变化过程中起重要作用，炎性因子作用在HIBD中的研究也逐渐成为热点。脑缺血后可产生炎症反应［3］，细胞因子表达增强。近年来发现，川芎嗪治疗脑缺血性疾病有良好疗效。IL8主要由单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞等产生，是最强的中性粒细胞趋化因子。作为致炎因子，它的信号传递由靶细胞膜上与G蛋白耦联的IL8受体介导。缺氧缺血早期由于能量代谢障碍，脑细胞无氧呼吸增加，神经元和星形胶质细胞等释放大量兴奋性氨基酸，产生毒性作用，使钙离子内流，细胞内钙超载，最终导致氧自由基大量释放，激活其他炎性因子释放，如IL1β、TNFα、LPS［4］，诱导IL8 产生增加。IL8表达部位主要在血管内皮细胞和脑胶质细胞，HIBD后白细胞浸润数量随IL8浓度上升而增多［5］。临床研究发现，缺氧缺血脑病（HIE）患儿血浆中IL8水平发病1 d后升高，可持续7 d以上。HIE患儿脑脊液中IL8水平明显高于对照组，和HIE病情轻重程度正相关［6］。本实验结果显示HIBD组和川芎嗪组脑内IL8浓度随时间延长逐渐上升，24 h达到最高峰后开始回落。HIBD组IL8浓度比对照组升高明显，各时间点变化有统计学意义（P<001）。川芎嗪治疗后IL8浓度较HIBD组下降，各时间点变化有统计学意义（P<001）。12 h时变化最明显，表明IL8参与了HIBD病理过程，川芎嗪可降低IL8浓度。Bacon认为钙通道阻滞剂可以抑制IL8受体介导的信号传递，抑制IL8的作用。川芎嗪作为一种钙通道拮抗剂对抗细胞内钙超载［7］，抑制IL8受体介导的信号传递，从而抑制IL8导致的炎症损伤，在HIBD中起脑保护作用。缺氧缺血早期能量代谢障碍，脑细胞无氧呼吸增加，胶质细胞、神经元、血管内皮细胞以及浸润的巨噬细胞都可分泌TNFα。TNFα作为重要的炎症细胞因子，是一种由活化的单核巨噬细胞分泌的促炎症因子，过度表达有明显的细胞毒性作用。研究表明［8］HIE患儿生后3 d内血清TNFα显著增高。局灶性脑缺血再灌注后TNFα浓度上升，川芎嗪可减轻TNFα加重的脑缺血再灌注损伤［9］。本实验结果显示TNFα在HIBD后表达较假手术对照组明显上升，12 h达到高峰后逐渐回落，48 h仍高于对照组。各个时间点HIBD组与对照组组间比较均有明显差异（P<001）。川芎嗪治疗组各相应时间点TNFα浓度较HIBD组降低，各时间点两组比较除0 h时没有明显的治疗作用外（P=0103），其余时间点均有P＜001，以48 h最为明显。HIBD后川芎嗪抑制脑组织表达TNFα，减轻脑组织损伤程度，在HIBD中起脑保护作用。研究证实IL10 可以抑制白细胞和小胶质细胞分泌IL1、IL6和TNFα，抑制白细胞聚集和趋化因子的产生，减轻缺氧缺血后的迟发损伤，具有脑保护作用［10］。IL10可以抑制Th1细胞发育从而减少促炎症细胞因子分泌，抑制炎症过程中抗原提呈、炎性细胞激活，降低细胞因子的合成及细胞因子受体的活性和表达，发挥较强的抗炎作用［11］。大鼠脑缺血后注射IL10， 24 h后发现脑梗死范围显著小于对照组［12］。腹腔注射IL10多克隆抗体，可提高大脑皮层cfos含量，促进凋亡，加重损伤程度［13］。本实验各组IL10浓度从0 h到48 h一直上升， HIBD组IL10 的含量高于对照组，各时间点比较有显著性差异（P<001）。川芎嗪治疗后浓度较HIBD组降低，各时间点两组比较有显著性差异（P<001）。以6 h时差别最明显。缺氧缺血时神经系统的保护反应、应激反应以及免疫调节等综合病理过程导致HIBD后IL10 的增加。川芎嗪改善脑内微循环、抗脂质氧化、减轻钙超载等，使脑内炎症 、神经系统的应激和免疫调节减轻，从而降低IL10浓度。本实验结果表明，HIBD后新生大鼠炎症细胞因子IL8、TNFα、IL10的浓度均升高，川芎嗪治疗后降低，从而减轻缺氧缺血性脑损伤后脑内炎症程度，起到脑保护的作用。

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作者单位：1 滨州医学院人体解剖学教研室 滨州市 256603；2滨州医学院病理生理学教研室