兔骨髓间充质干细胞定向诱导分化为成骨细胞的研究

【摘要】  目的 探讨兔骨髓间充质干细胞﹙bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs﹚体外分离培养、诱导分化为成骨细胞的方法，并研究其生物学特性。方法 采用体外细胞培养技术自兔股骨、胫骨及肱骨中分离BMSCs进行纯化、培养。用地塞米松、β甘油磷酸钠、维生素C定向诱导BMSCs分化为成骨细胞，改良MTT法测定其生长曲线，NBT/BCIP染色法、P对硝基苯基质法及茜素红染色法检测BMSCs的成骨能力。结果 成骨诱导1~5 d，培养的细胞增殖旺盛，3~5 d即可融合成单层，随着诱导时间的延长，细胞增殖速度减慢，出现细胞聚集的现象，培养细胞逐渐汇合呈铺路石状，细胞形态变为胞体较小的立方形，继续诱导，可出现多角形成骨样细胞，胞外基质分泌逐渐增多，胶原堆积、钙盐沉积，10~12 d形成不透光矿化结节，ALP活性增高，茜素红染色阳性，表示BMSCs向成骨细胞分化。结论 兔BMSCs经体外分离、诱导培养，可以定向分化为成骨细胞。

【关键词】  骨髓间充质干细胞；诱导分化；成骨细胞

    Study on rabbit bone marrow mesenchymal stem cells differentiation to the osteoblasts in vitro

    LI Yanuo1 SUN Yan2 ZHANG Ling3 et al

    1Department of Histology and Embryology, Binzhou Medical University, Yantai 264003;

    2 Department of Orthopedics, Longkou Herbalist Hospital;

    3 Yunnan Pharmacological Laboratories of Natural Products

    【Abstract】 Objective To investigate the isolation and cultivation of bone marrow mesenchymal stem cells ﹙BMSCs﹚from the bone marrow of rabbit and induce them to differentiate into osteoblasts in vitro. Methods BMSCs were harvested from the femurs, tibias and humerus bones of the rabbit, then separated, purified and proliferated. After primary culture, the subcultured cells were cultured in osteogenesis inducing medium including dexamethasone, βglycerophosphate, Lascorbic acid, then stained with NBT/BCIP and alizarin red. Results The BMSCs of rabbit showed active proliferative capability in primary and passage cultures. After 8 days of osteoblast inducing, the BMSCs congregated , showed typical cuboidal shape and formed mineralized nodule. The expression of alkaline phosphatase was positive. Conclusion The BMSCs isolated and cultured can be induced into osteogenesis committed differentiation.

    【Key words】 bone marrow mesenchymal stem cells, induced differentiation,osteoblasts

    由于肿瘤、外伤和骨骼异常等原因引起的大段骨缺损往往需要骨的重建，目前常规的方法有自体或异体、异种骨移植，但都存在一定的问题和限制，难以完全满足临床需要。组织工程化骨组织的研究为骨缺损修复开辟了新的途径，但是在骨组织工程产品进入临床应用前，尚存在一些障碍有待克服，其中如何获得大量种子细胞是目前面临的最关键性的制约因素。近年来干细胞尤其是骨髓间充质干细胞﹙BMSCs﹚的研究为解决这一难题提供了可能。BMSCs是位于骨髓基质中的一类中胚层来源的未分化细胞，具有很强的自我更新和多向分化潜能，在一定诱导条件下，可以分化为成骨细胞、成软骨细胞和成肌细胞等，还可以分化为巨噬细胞、脂肪细胞、内皮细胞和成纤维细胞等骨髓基质细胞，具有发育为骨、软骨、脂肪、肌肉、真皮及骨髓基质等中胚层组织的潜能［1~3］。此外，BMSCs具有取材容易，对机体损伤小，增殖力强，易稳定表达成骨细胞表型等优点，因此可作为骨组织工程的较好的种子材料。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 实验动物：日本大耳兔12只，6~8周龄，雌雄不拘，体重（250±50）g，由昆明医学院实验动物中心提供。

    1.1.2 试剂和药品：LDMEM(GIBCO)，HEPES(CXBIO)，胎牛血清（杭州四季青公司），胰蛋白酶（BBI），EDTA(CXBIO)，MTT(SIGMA)，三联液（10％十二烷基硫酸钠，5％异丁醇，0.012mol/L盐酸），地塞米松（SIGMA），β甘油磷酸钠（中国医学科学院生物医学工程研究所），维生素C（CXBIO），NBT/BCIP染色试剂盒（SIGMA公司），茜素红（上海化学试剂厂） ，ALP（日本和光纯药工业株式会社）。

    1.2 方法

    1.2.1 BMSCs的分离、原代和传代培养：耳缘静脉注入少许空气处死日本大耳兔，75% 乙醇内浸泡10 min后，无菌条件下逐层切开皮肤及皮下组织，剥离附着于四肢长骨的肌肉，完整切取双侧股骨、胫骨和肱骨，PBS冲洗3遍；将各长骨两侧干骺端切除，充分显露骨髓腔，用7号针头的注射器吸取不含血清的LDMEM培养基冲洗骨髓腔，从长骨的另一端收集冲洗出来的骨髓，用吸管轻轻吹打成细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，弃上清和脂肪，加入含20％FBS的LDMEM培养基吹打成细胞悬液，调整细胞密度至1×106个/ml并接种于50 ml培养瓶中，置于37℃，饱和湿度，5％CO2培养箱培养。12 h后轻柔摇动培养瓶1次，使红细胞从底壁上脱离；48 h首次半量换液，弃去部分悬浮细胞；72 h全换液，以后每2~3 d根据培养基颜色全量换液。原代培养第8~12天，贴壁细胞逐渐开始融合并覆盖培养瓶底面达80％以上，吸除培养基并用PBS洗涤贴壁细胞2次，加入025％ 胰蛋白酶和002%EDTA混合消化液 2~3 ml，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面。消化期间倒置显微镜下观察，待细胞收缩变圆，即将脱离瓶壁时，吸去消化液，立即用含10％FBS的LDMEM培养基终止消化。用弯头吸管吸取瓶内培养基，反复吹打贴壁细胞，吹打时动作要轻柔，尽可能不要出现泡沫，细胞脱壁后形成单细胞悬液。将细胞悬液收集到离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入含10％FBS的LDMEM培养基将细胞重新打匀后，按1∶3比例进行传代培养。

    1.2.2 定向诱导BMSCs向成骨细胞分化：第2、3、5代BMSCs长至80％融合后，常规传代，细胞以1×104个/ml密度接种于放置有1 cm×1 cm盖玻片的24孔板中，细胞达到80％融合后，更换为成骨诱导培养基（LDMEM培养基，10％FBS，Dex 10－8mol/L，βGP 10 mmol/L，Vit C 50 mg/L，青霉素100 U/ml，链霉素100 μg/ml，pH 7.2）。对照组继续加常规培养基，每3 d换液一次。诱导期间倒置相差显微镜下逐日观察细胞生长、增殖情况及形态特征，并随时拍照记录。

    1.2.3 生长曲线测定：第3代BMSCs长至80％融合后，常规传代，细胞以1×104 个/ml密度接种于7块96孔培养板，每孔90 μl，每板接种16孔，细胞达到80％融合后，8孔更换成骨诱导培养基，8孔继续加常规培养基，每3 d换液1次。从第2天起每隔24 h取出一块培养板，在成脂诱导孔和对照孔内各加入10 μl MTT（5 mg/ml）溶液，置于37 ℃，饱和湿度，5％CO2孵箱培养4 h后取出，每孔加入三联液100 μl，再次置于37 ℃，饱和湿度，5％CO2孵箱培养12 h后取出。用酶标检测仪在570 nm、630 nm双波长下测定各孔光密度（OD）值，连续测7次，取8个孔光密度的平均值，以时间（d）为横坐标，光密度（OD值，表示细胞相对数量）为纵坐标，绘制生长曲线。

    1.2.4 碱性磷酸酶﹙ALP﹚活性定性检测（NBT/BCIP染色法）：分别于成骨诱导的第4、7、14天各取实验组、对照组的细胞爬片PBS冲洗2次，用滤纸吸去多余水份，4％多聚甲醛固定30 min，用NBT/BCIP试剂盒避光染色1 h后，用流水冲洗，倒置显微镜下观察并拍照记录。

    1.2.5 碱性磷酸酶﹙ALP﹚活性定量检测（P对硝基苯基质法）：分别于成骨诱导的第4、7、14天，每孔加入少许0.25％ 胰蛋白酶和0.02% EDTA混合消化液消化，再加入含10％FBS的LDMEM培养基终止消化，吹打成细胞悬液。将细胞悬液用超声粉碎仪粉碎2 min后800 r/min离心8 min，取上清液用全自动生化分析仪进行ALP活性测定。

    1.2.6 钙结节检测﹙茜素红染色﹚：分别于成骨诱导的第4、7、14天各取实验组、对照组的细胞爬片PBS冲洗2次，用滤纸吸去多余水份，95%乙醇固定20~30 min，茜素红染液中浸染5～10 min后，用流水冲洗，倒置显微镜下观察并拍照记录。

    2 结果

    2.1 BMSCs的原代及传代培养 原代、传代细胞的形态相似，均有较强的增殖能力。原代培养细胞刚接种时，培养瓶中有大量悬浮细胞，24 h后部分细胞开始贴壁伸展变形，刚贴壁的细胞单个排列，呈圆形或多角形，胞体透亮折光性强；48~72 h后呈纺锤形或梭形，每个细胞形成一个集落，增殖迅速，集落之间相互靠近；培养4 d后见贴壁生长的细胞数量明显增多，细胞形态出现较大变化，可见成纤维样细胞散布于培养瓶底，并有多个集落形成，细胞围绕中心呈漩涡状排列。5~8 d期间集落逐渐增多，此后逐渐增大，并融合为单层。当培养至第9~12 d时，细胞已大部分融合，长满瓶底，细胞成长梭形（成纤维样外观），有的细胞呈交叉重叠生长。原代细胞培养8~12 d后，消化传代，传代细胞贴壁较快，刚传代的细胞呈圆形。4 h后可见明显的贴壁细胞散在分布；24 h见贴壁细胞呈单层生长，伸展为短梭形、长梭形。原代培养局部区域存在少许小而圆的细胞，传代后消失。第3代以后，细胞形态趋于一致。传代细胞约5 d基本长满瓶底，细胞形态为成纤维细胞样，见图1、2。

    2.2 BMSCs诱导为成骨细胞的形态变化 成骨诱导1~5 d，培养的细胞增殖旺盛，3~5 d即可融合成单层，细胞形态仍保持长梭形，实验组与对照组无明显差异。随着诱导时间的延长，实验组细胞增殖速度减慢，开始出现细胞聚集的现象，培养细胞逐渐汇合呈铺路石状，细胞形态发生改变，由梭形变为胞体较小的立方形，高倍镜下可见细胞呈复层生长。继续诱导，出现多角形成骨样细胞，胞质颜色变深，含粗大颗粒，胞核明显，胞外基质分泌逐渐增多，胶原堆积、钙盐沉积，10~12 d形成不透光矿化结节，见图3、4。

    图3 成骨诱导第8天，细胞重叠生长，

    出现细胞聚集的现象﹙×100﹚图4 成骨诱导第10天，形成不透光的

    钙化结节﹙×100﹚ 2.3 生长曲线分析﹙改良MTT法﹚ 第3代BMSCs的生长曲线见图5。对照组生长曲线呈S形，传代接种后第1、2天细胞增殖缓慢为潜伏适应期，从第3天开始细胞增殖加速，细胞数目呈指数级递增，此期为BMSCs的对数生长期。至第7天达到顶点。成骨诱导组与对照组第0天的光密度值（OD值）基本相同，随着诱导时间延长，BMSCs在成骨诱导培养基的作用下，逐渐向成骨细胞转化，但BMSCs仍具有增殖能力，成骨生长曲线与对照组类似。

    图5 第3代BMSCs的生长曲线

    2.4 碱性磷酸酶﹙ALP﹚活性定性检测（NBT/BCIP染色法） 成骨诱导第4天，成骨诱导组部分细胞染色出现淡蓝紫色，成骨诱导第7天，大部分染色为强阳性，对照组有部分细胞染色为淡紫蓝色，见图6。

    A. 对照组，碱性磷酸酶染色，呈阴性。

    B. 成骨诱导组，碱性磷酸酶染色，呈强阳性。

    图6 成骨诱导第7天，碱性磷酸酶染色﹙×100﹚

    2.5 碱性磷酸酶﹙ALP﹚活性定量检测（P对硝基苯基质法） 各孔细胞经消化、定容、超声粉碎、离心后，取细胞上清液用全自动生化分析仪检测ALP活性，结果如表1，图7所示。表1 不同时间细胞上清液ALP

    2.6 钙结节检测﹙茜素红染色﹚ 成骨诱导的第7天，成骨诱导组可见重叠生长的细胞逐渐形成结节状，随后胶原堆积及钙盐沉积，最后形成不透光矿化结节，茜素红染色为棕红色，而对照组未见钙结节，茜素红染色阴性，随诱导时间延长，钙结节明显增多，见图8。

       3 讨论

    BMSCs位于骨髓基质中，在体外可以通过贴壁培养加以分离，分裂增殖能力强，可以向多种结缔组织细胞﹙纤维、骨、软骨、肌腱、肌肉、脂肪等﹚分化，并易于被外源基因转染且稳定表达，因此被认为是组织工程理想的种子细胞、细胞及基因治疗理想的靶细胞［４］。刺激BMSCs向成骨细胞分化的物质很多［5，6］，如骨形态发生蛋白、转化生长因子β、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、降钙素等，其中以Dex、βGP和Vit C联合促进BMSCs向成骨细胞分化的方法最为常用。Vit C是胶原中脯氨酸和赖氨酸末端羟基化的共同影响因子，能通过诱导成骨细胞特异性分化蛋白基因的表达来诱导ALP活性的增加。同时，Vit C能增加钙盐的沉积和促进钙化骨结节的形成［7］。βGP可为成骨细胞的分化和增殖提供磷原子，能增加ALP的表达，促进钙盐沉积，促进钙化［8］。Dex是BMSCs体外成骨的必需成分，体外培养的BMSCs只有加入Dex才能形成钙化结节［9］。虽然Dex对BMSCs的增殖有抑制作用，但Dex在抑制BMSCs增殖的同时可明显增加ALP的活性，Dex浓度越高作用越明显［10］。碱性磷酸酶﹙alkaline phosphatase，ALP﹚是成骨细胞分化的标志，在体外钙化中起关键性作用。目前认为，ALP能够水解有机磷酸酯，使局部PO43-浓度升高，并可破坏钙化抑制剂，从而启动钙化，ALP活性越高，说明前成骨细胞向成熟成骨细胞分化越明显。骨组织是通过骨基质钙化而形成，而骨基质由成骨细胞所合成、分泌；在基质开始钙化时，成骨细胞的ALP活性最高，在钙化接近结束时，活性则最低，其活力在一定程度上反映成骨细胞的分化程度和功能状态［11］。本研究采用NBT/BCIP染色法、P对硝基苯基质法及茜素红染色的方法检测BMSCs的成骨能力。NBT﹙硝基蓝四氮唑﹚与SCIP﹙5溴4氯3吲哚磷酸盐﹚是碱性磷酸酶最佳的底物组合之一，显色反应产物为蓝色，不溶于水、乙醇及二甲苯。本研究选用了此染色方法，发现随诱导时间的延长，染色由淡紫蓝色变为深紫蓝色，ALP的活性检测也与之相符。矿化结节是鉴定成骨细胞及其功能的另一重要指标，茜素红染色可见钙结节呈橘红色或棕红色。本实验采用Dex、βGP和Vit C联合诱导的方法，作用5 d后发现BMSCs形态由细长梭形逐渐变为多角形和方形，细胞外基质分泌增多，细胞之间出现明显的钙化结节。ALP染色发现ALP表达阳性，茜素红染色发现钙化结节。证实了兔BMSCs能够在Dex、βGP和Vit C联合诱导下向成骨细胞转化，并且不影响细胞的增殖，可迅速大量地获得细胞，为骨组织工程提供大量的种子细胞。兔骨髓间充质干细胞﹙BMSCs﹚在体外培养取材容易，对机体损伤小，增殖力强，经多次传代，细胞仍生长稳定、增殖速度快、贴壁率高、适应性强、接种成活率高，并且可以定向诱导分化为成骨细胞。因此，可作为骨组织工程的较好的种子材料。

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作者单位：1 滨州医学院组织学与胚胎学教研室 烟台市 264003； 2 龙口市中医院骨科；3 云南省天然药物药理重点实验室