应用GFP标记基因研究RNAi载体的抑制效果

【摘要】  目的 用绿色荧光蛋白（GFP）反映RNA干扰（RNAi）载体的转染率，以研究RNAi载体的抑制效果。方法 将GFP基因和RNAi片段（特异性针对Bcl2基因）连接至pC1载体上，构建共表达载体GFP/RNAi及其对照载体，转染293细胞，用荧光显微镜、流式细胞仪检测细胞的GFP转染率，并用TRPCR分析RNAi抑制Bcl2 mRNA表达的效果。结果 在293细胞中，GFP的转染率可达85%以上，此时观察到RNAi有效的抑制了Bcl2 mRNA的表达。结论 在RNAi实验时，可选用GFP等标记基因作为载体转染率的判断标准，以进一步判断RNAi的作用效果。构建的RNAi载体有效的抑制了Bcl2的表达，为下一步抑制肿瘤细胞的生长提供科学资料。

【关键词】  绿色荧光蛋白；RNA干扰；Bcl2 ；细胞转染

基金资助项目：山东省教育厅基金（106L01），滨州医学院科研启动基金BY2005KYQD19

    Studying the suppression effect of RNAi by using GFP gene as a marker

    XIE Shuyang WANG Pingyu YUE Zhen et al

    Department of Biochemistry and Molecular Biology,Binzhou Medical University,Binzhou 256603

    【Abstract】 Objective Studying the suppression effect of RNAi by using green fluorescence protein (GFP) to reflect the transfection rate.Methods GFP gene and RNAi segment specific to Bcl2 gene was inserted into pC1 vector to construct the coexpression vector (GFP/RNAi), after 293 cells were treated with GFP/RNAi vector, the transfection rate was estimated from GFP by using fluorescence microscopy as well as FACS analysis, and the suppression of Bcl2 mRNA expression was detected by RTPCR.Results The transfection rate was above 85% from detection of GFP positive cells, and the Bcl2 mRNA expression was also decreased to 50% as its control group.Conclusion The marker gene (such as GFP) may be used to reflect transfection rate in RNAi experiment, because the transfection rate is important for the inhibitive effect of RNAi. The suppression of Bcl2 expression is crucial to inhibit proliferation of tumor cells.

    【Key words】 GFP,RNAi, Bcl2,Gene expression

    绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)是来源于发光水母(aequorea victoria)的一种功能独特的蛋白质。GFP受光激发产生荧光是一个特异性的独立过程，在异源细胞内融合表达后可自发环化成熟，自发产生荧光且对异源细胞内的生理过程无干扰，可应用于活体细胞的适时检测。GFP是一种稳定蛋白，即使在较高浓度的强毒性药剂(如HCI胍、尿素、硫酸盐等)中延长孵育时间，荧光仍可持续存在［1］。研究证明EGFP是一种良好的报告基因和筛选标志［2］，为进一步研究应用最广泛的哺乳动物细胞表达系统奠定了基? １狙芯垦∮肎FP作为标记基因，构建GFP/RNAi表达载体，用GFP的转染率反映细胞转染率，进一步判断RNAi对目的基因的作用效果，为体外进行RNAi实验提供科学的依据。

    1 材料与方法

    1.1 材料 脂质体2000购自Invitrogen公司，pC1载体购自Promega公司，RNA 提取试剂盒购自UGENE公司，NheI、SalI等酶、逆转录酶购自TaKaRa公司，293细胞株购自中科院上海细胞生物研究所，DMEM培养基、胎牛血清购自GIBCO公司，GFP表达载体（Invitrogen）。测序及引物合成由山东吉正科技有限公司完成。

    1.2 方法

    1.2.1 RNAi元件的设计和实验所用载体：依赖RNA 聚合酶Ⅲ的H1启动子通过PCR从人基因组DNA中扩增获得［3］。Bcl2干扰片段的设计参考Tiscornia等报道［4］进行。正向片段序列为：5'AGCTCCCGCGATAGTGATGAAGTACATCTTCAAGA

    GAGATGTACTTCATCACTATCTTTTTGGAAAA3'，反

    向片段序列为5'CTAGTTTTCCAAAAAGATAGTGATGAAGTACATCTCTCTTGAGATGTACTTCATCAC

    TATCGGG3'；两片段缓慢退火后，将干扰片段克隆到T载体上，得到干扰载体Ti，并测序证明干扰片段序列正确。然后利用BamHI将RNA干扰序列及H1启动子克隆至pC1载体上，同时利用XbaI和SalI将GFP基因克隆至CMV启动子构建GFP/RNAi载体（图1）， 并构建对照载体GFP/Control。

    pCMV:人巨细胞病毒启动子； pH1:H1启动子； RNAi: 特

    异性针对Bcl2序列的干扰片段；GFP:绿色荧光蛋白基因。

    图1 载体及其结构

    1.2.2 细胞培养及转染：293细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2条件下培养。然后，将1 μg GFP/RNAi干扰载体，采用脂质体方法转染到293细胞中，细胞转染方法按厂家说明进行。如表1所示。

    表1 293细胞转染剂量分 组GFP/RNAi (μg)GFP/Control (μg)293blank（空白对照组）--293GFP/Control（对照组）-05293GFP/RNAi（干扰组）05-1.2.3 细胞GFP检测与分析

    1.2.3.1 荧光显微镜观察：细胞转染72 h后，胰酶消化后，PBS洗一次，用细胞计数板将各实验组细胞浓度调至一致，用荧光显微镜（Leica，DMRXA2）观测荧光。

    1.2.3.2 FACS分析：收集细胞，用PBS洗涤，加鞘液后，用流式细胞仪（Becton Dickinson FACS Calibur）分析细胞GFP表达情况。

    1.2.4 Bcl2表达的检测：RTPCR分析：提取293细胞总RNA，进行逆转录反应，然后通过PCR扩增Bcl2及参照基因GAPDH cDNA。Bcl2扩增引物为5'TTGCCACGGTGGTGGAGGA3'和5'ACAGCCAGGAGAAATCAAACAG3'；GAPDH扩增引物为5'GTCTTCACCACCATGGAGAAGG3'和5' GCCTGCTTCACCACCTTCTTGA3'。PCR条件为：94℃变性 4 min，然后94℃ 1 min, 56℃ 45 s, 72℃ 1 min, 共24个循环，最后72℃ 延伸10 min。PCR产物用2%的凝胶进行电泳分析。

    2 结果

    2.1 RNAi抑制NIH3T3细胞目的基因表达情况

    2.1.1 转染率的观察：NIH3T3细胞转染GFP/RNAi和GFP/Control载体后，荧光显微镜观察发现，GFP表达数量较强，反映转染率较高（图2），进一步用FACS分析GFP阳性细胞率，发现GFP阳性细胞为82.3%（图3），说明载体的转染率为80%以上。

    图2 293细胞荧光表达情况（100×）

    图3 FACS分析293细胞干扰GFP表达

    2.1.2 RNAi载体抑制Bcl2的表达：在转染率为80%以上时，提取实验各组细胞的RNA，进行逆转录PCR反应，结果如图4示，干扰组（GFP/RNAi组）由于RNAi的干扰作用，使Bcl2 cDNA表达量降低（图4A），而参照基因GAPDH的cDNA表达量并没有发生明显的变化（图4B），表明所设计的siRNA载体能有效的抑制目的基因Bcl2 cDNA的表达。

    A. Bcl2表达分析，B. GAPDH表达分析；1: GFP/RNAi group

    （干扰组），2: GFP/Control group (对照组)， M:100bp marker。

    图4 RTPCR分析RNAi抑制Bcl2表达

    3 讨论

    RNAi的主要机制如下：转录后沉默( post transcriptional gene silencing , PTGS) 机制，根据此模型,基因沉默的第一步,是通过某种机制来识别双链RNA并使之转换成21～25个核苷酸大小的小RNA分子，被称为小分子的干涉RNA(small interfering RNA, siRNA)。siRNA的出现是RNAi 及其他基因沉默现象的重要特征［5，6］。siRNA通过与RISC共同发挥作用, 使沉默复合物识别靶目标［7，8］，从而抑制目的基因表达。而siRNA的抑制效果主要与转染率和抑制率有关［9，10］，siRNA的转染率与细胞状态、siRNA的纯度和浓度等都有密切关系，不难推测在转染特异性的siRNA至细胞时，转染率应该大于70%。Bcl2是一种原癌基因，编码一个26 kD 的蛋白，定位于细胞内质网膜线粒体膜和核膜上,是一种膜定位蛋白，促进细胞由G1期向S期转化并修复染色体损伤，或在细胞分化早期通过对抗前凋亡分子Bax 延长细胞的生存期，使细胞永生化，与肿瘤的早期形成有关［11~14］。实验中我们用GFP作标记物反映siRNA的转染率，研究siRNA对目的基因Bcl2的抑制作用。研究发现，当GFP表达率达80%以上时，RTPCR显示Bcl2基因表达受到了明显的抑制。本研究表明，在体外siRNA时，可选用GFP作为标记基因，研究siRNA对目的基因的抑制作用。本实验对Bcl2基因表达的抑制实验还为下一步进行肿瘤细胞的生长提供科学的资料。

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作者单位：1 滨州医学院生物化学与分子生物学教研室 滨州市 256603；2 滨州市肿瘤医院