雌、孕激素对ET1诱导的心肌细胞肥大反应的影响

【摘要】  目的 观察不同浓度的17β雌二醇（E2）和孕酮（P）单独及联合运用对内皮素1 (ET1)诱导的心肌细胞肥大反应的影响。方法 以ET1刺激体外培养的新生大鼠心肌细胞，建立心肌肥大细胞模型，以心肌细胞［3H］亮氨酸（3Hleu）掺入作为心肌肥大反应的指标。结果 E2可明显抑制ET1诱导的心肌细胞3Hleu掺入的增加，而P对此无显著作用；E2/P联合运用时，P对E2降低ET1诱导的心肌细胞3Hleu掺入增加的作用具有一定程度的抑制作用。结论 E2可抑制ET1诱导的心肌细胞肥大反应，E2/P联合使用时，P可一定程度的抑制E2对心肌的保护效应，应用时应以低浓度为宜。

【关键词】  17β雌二醇 孕酮 心肌细胞 肥大反应

    The effects of 17βestradiol and progesterone on cardiomyocyte hypertrophy induced by endothelin1

    PAN Hong1  WANG Guihua1  WANG Tinghuai2

    1 Department of Physiology, Binzhou Medical University, Binzhou 256603;

    2 Department of Physiology,Preclinical Medical College, Sun YatSen University

    【Abstract】  Objective  To investigate the effects of 17βestradiol (E2) or progesterone(P) alone and combined  E2/P treatment on cardiomyocyte hypertrophy induced by endothelin1（ET1）.Methods  Myocardial cells from neonatal rats were cultured in vitro and cardiomyocyte hypertrophy model was established with ET1. Cardiomyocyte hypertrophic response was assayed by 3Hleucine（3Hleu） incorporation.Results  Pretreatment with E2 could inhibit the increase of 3Hleu incorporation induced by ET1, while P had no significant effect on this increase.With combined E2/P Treatment, P could weaken  the inhibitive  effect of E2 on  the increase of 3Hleu incorporation induced by ET1 to some extent.Conclusion  E2 can inhibit cardiomyocyte hypertrophy induced by ET1.With combined E2/P treatment,P can attenuate the protective effect of E2 on myocardium to some extent，so it is better for us to use the lower concentration of E2 and P.

    【Key words】  17βestradiol，progesterone，cardiocyte，hypertrophic response

    大量的基础及临床试验研究证实雌激素对心血管系统具有保护作用［1］，雌激素替代治疗(estrogen replacement therapy，ERT)可显著改善女性绝经引发的一系列症状，降低心血管事件的发生率，提高老年妇女的生命质量。但长期单纯应用雌激素可增高女性子宫内膜癌的发病率［2］，临床试验证实加用小剂量孕激素可抑制雌激素的致癌副作用，有效降低子宫内膜癌的发生危险［3］，但孕激素是否干扰雌激素对心血管系统的保护作用，目前还存在争议［4,5］。本课题拟在培养的新生SD大鼠心肌细胞上，以心肌细胞［3H］亮氨酸（3Hleucine,3Hleu）掺入作为心肌细胞肥大反应的指标，观察17β雌二醇（17βestradiol，E2）和右旋孕4烯3,20二酮（progesterone，P）单独使用以及E2/P联合运用对内皮素1 (endothelin1，ET1)诱导的心肌细胞肥大反应的影响。旨在探讨女性激素对心血管系统功能的影响，并为绝经后妇女应用安全有效的激素替代治疗提供新的实验参考和依据。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物  出生1～3 d的SpragureDawley种系大鼠，雌雄不限，由中山大学动物实验中心提供，动物合格证号：粤监证字2004A089。

    1.2  主要试剂  E2、P、ET1、5溴脱氧尿嘧啶核苷（5bromodeoxyuridine，5Brdu）、胰蛋白酶（trypsin）购自Sigma公司，DMEM培养基购自Gibco公司，HEPES购自生工生物工程（上海）有限公司，新生小牛血清为Hyclone产品，3Hleu为中国原子能科学研究所产品，其余均为国产分析纯。

    1.3  主要实验仪器  Eppendorf高速离心机（centrifuge5417型，德国），78HW1型恒温磁力搅拌器（杭州仪表电机厂），Galaxy二氧化碳培养箱（Stephen Clark Fabrications Ltd，英国），XSZD2型倒置显微镜（重庆光学仪器厂），LS 3801液体闪烁计数仪（Beckman，德国），IBAS图像分析系统（Kontron Elektronik，德国）。

    1.4  心肌细胞培养  按Simpson等［6］描述的方法培养新生大鼠心肌细胞。取出生1～3 d的SD大鼠心脏，以0.08％的无菌胰蛋白酶消化分离心室肌细胞，差速贴壁法纯化心肌细胞，并在培养前48 h，在心肌细胞培养液中加入0.1 mmol/L的5Brdu，以抑制非心肌细胞的生长。

    1.5  心肌细胞3Hleu掺入的测定  差速贴壁后，将心肌细胞以3×105 cells/ml密度接种于24孔培养板。48  h后换为无血清无酚红的DMEM培养液培养24 h，加或不加不同浓度（10-10～10-6mol/L）的E2、P预处理24 h，再加入10-8mol/L的ET1作用24 h后，每孔加入37 kBq/ml的3HLeu继续孵育16 h，移去培养液，用10％的三氯乙酸0.5 ml 4℃固定30 min，再用预冷的DHank's液清洗两遍，最后用含1％SDS的0.2 mol/L的NaOH溶液0.5 ml裂解细胞，37℃孵育12 h后收集裂解液于含有8 ml闪烁液的测量杯中，摇匀放置在液体闪烁仪上测定放射性强度。

    1.6  统计学处理  数据以均数±标准差（x ± s）表示，以t检验和单因素方差分析作统计学处理，P＜0.05为有统计学意义。

    2  结果

    2.1  ET1对心肌细胞形态的影响  用胰蛋白酶消化分离的新生SD大鼠心室肌细胞在培养72 h后，加入ET1（10-8mol/L），24 h后，心肌细胞呈现明显的肥大（图1）。

    a.正常心肌细胞            b.肥大心肌细胞

    图1  ET1诱导的肥大心肌细胞(×200)

    2.2  E2预处理对ET1诱导的心肌细胞3Hleu掺入增加的影响  与对照组相比，10-8mol/L ET1可使心肌细胞3Hleu掺入增加（88.67±15.05）％（n＝6，P＜0.01）；该作用可被E2预处理24 h后明显抑制，10-10～10-6mol/L E2分别使ET1处理的心肌细胞3Hleu掺入下降，详见表1，其中以10-8mol/L E2作用最为明显；单独给予E2对心肌细胞3Hleu掺入没有显著影响（n＝6，P＞0.05）。表1  不同浓度E2对ET1诱导的心肌细胞3Hleu 注：与空白对照组比较*P＜0.01；与ET1组比较#P＜0.01

    2.3  P预处理对ET1诱导的心肌细胞3Hleu掺入增加的影响  与对照组相比，10-8mol/L ET1可使心肌细胞的3Hleu掺入增加（94.48±27.18）％（n=6,P＜0.01）；10-10～10-6mol/L P预处理24 h对ET1诱导的心肌细胞3Hleu掺入的增加无显著影响，详见表2。表2  不同浓度P对ET1诱导的心肌细胞3Hleu 掺入增加的影响  注：与空白对照组比较*P＜0.01

    2.4  E2与P联合运用对ET1诱导的心肌细胞3Hleu掺入增加的影响  为了探讨E2/P联合应用对心肌肥大反应的影响，我们进一步以10-10、10-8、10-6mol/L的E2降低ET1诱导的心肌细胞3Hleu掺入增加作为对照，分别观察了10-10、10-8、10-6mol/L的E2与10-10、10-8、10-6mol/L的P联合运用时对心肌细胞3Hleu掺入的影响。结果发现，与对照组相比，10-8mol/L ET1可使心肌细胞的3Hleu掺入增加（76.92±23.30）％（n=6,P＜0.01）； 该作用可被E2预处理24 h后明显抑制，10-10、10-8、10-6mol/L E2分别使心肌细胞3Hleu掺入下降（21.41±1.66）％、（31.30±3.10）％、（25.90±1.75）％（n=6,P＜0.01）；当E2/P联合应用时，10-6mol/L的P对10-6、10-8mol/L的E2降低ET1诱导的心肌细胞3Hleu掺入增加的作用具有明显的抑制作用（n=6,P＜0.05），这种抑制作用不存在明显的剂量效应相关，而当E2的浓度为10-10mol/L时，同样10-6mol/L的P对E2的作用则未见显著影响（n=6,P＞0.05）；E2与P的其他浓度联合运用时，P对E2降低ET1诱导的心肌细胞3Hleu掺入增加的作用均无明显的抑制（n=6,P＞0.05），详见表3。 表3  E2/P联合运用对ET1诱导的心肌细胞3Hleu掺入增加的影响  注：与空白对照组比较△P＜0.01；与ET1组比较*P＜0.01；与E2（10-8mmol/L，+ET1组比较  #P＜0.05；与E2（10-6mol/L)+ET1组比较  ▲P＜0.01。

    3  讨论

    心肌细胞存在ET1特异性受体［7］，ET1可作为重要的致肥厚因子参与心肌肥大反应［8］。本实验证实，加入ET1后，心肌细胞呈现明显的肥大。心肌肥大作为高血压病的常见并发症，目前已经被列为导致心血管疾病发病率和死亡率增高的独立危险因子［9］，因此防治心肌肥大具有十分重要的意义。研究发现，雌激素具有心血管保护效应［1］，激素替代疗法可显著降低绝经后妇女发生左心室肥厚的危险性［10］，提示雌激素可能对心肌肥大具有抑制作用。我们在实验中观察到，在ET1刺激状态下，10-10～10-6mol/L的E2对ET1诱导的心肌细胞肥大反应均有明显的抑制作用，表现为ET1诱导的心肌细胞3Hleu掺入增加的显著降低；而在基础状态下，E2本身对于正常心肌细胞3Hleu掺入则无显著影响，提示在细胞水平E2可抑制ET1诱导的心肌肥大反应。

    多年来雌激素对心血管系统的保护作用一直是研究的热点，而孕激素对心脏及血管功能影响的研究相对较少，结论也不尽相同。Vedernikov等［11］研究发现单独使用孕激素对氯化钾诱导的主动脉环收缩和乙酰胆碱诱导的主动脉环舒张效应均无明显影响。但是也有研究发现，孕激素可通过舒张肺血管发挥一定的血管保护效应［12］。在我们的实验中观察到10-10～10-6mol/L 的P单独作用对ET1诱导的心肌细胞肥大反应无显著影响。

    长期单独使用ERT可增加子宫内膜癌的发病危险，为避免以上危险，常联合使用雌、孕激素，但是雌孕激素的联合使用是否会削弱雌激素对心血管系统的保护作用？我们的实验结果显示，E2/P联合使用时，当E2为低浓度（10-10mol/L）时，即使高浓度的P（10-6mol/L）也不影响E2对ET1诱导的心肌肥大反应的抑制作用，而当E2的浓度为10-6、10-8mol/L时，同样浓度的P对E2抗心肌肥大的作用产生显著的抑制作用。这就表明，P在一定浓度范围内可以拮抗E2对心肌肥大的抑制作用，且这一拮抗作用不仅与P的浓度有关，还与E2的浓度有关。当P和E2均为低浓度时，P才不致影响E2对心肌肥大反应的抑制作用。Wassmann等［13］在大鼠血管平滑肌细胞上也得到了与我们的实验相类似的结果。这就提示我们孕激素的联合使用可能的部分抵消了雌激素对心血管系统的部分保护效应。在2002年7月提前终止的WHI关于雌孕激素连续联合治疗组（每日结合雌激素0.625 mg＋甲羟孕酮2.5 mg）的临床研究中，中期总结报告发现激素替代疗法可增加心血管疾病的风险，其原因可能也与孕激素的联合使用有关。因此，需要进一步深入研究激素替代治疗中加用孕激素对心血管系统功能的影响，以阐明其机制，为绝经后妇女进行安全有效的激素替代治疗提供更多的实验参考和依据。

    综上所述，在细胞实验中我们的研究结果表明单独使用E2可明显抑制ET1诱导的心肌细胞肥大反应，而P对此无明显作用。当E2/P联合运用时，高浓度的P可一定程度的抑制E2对心肌的保护效应，当P和E2均为低浓度时，P才不致削弱E2对心肌肥大反应的抑制作用，但是此浓度是否能保留P对E2所致的子宫内膜过度增生的抑制作用还不清楚，需要在下一步的实验中继续探讨。本实验将有助于加深对性激素在心血管系统作用的了解，为绝经后妇女应用激素替代疗法中雌孕激素的适当配伍问题提供一定的实验参考。

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作者单位：滨州医学院生理学教研室 滨州市 256603