轮状病毒VP4蛋白酶切片段VP5*、VP8*在原核系统中的表达

【摘要】  目的 克隆表达轮状病毒结构蛋白VP4酶切片段VP5*、VP8*。方法 以猴轮状病毒SA11株细胞培养物提取总RNA为模板，经RTPCR方法获得VP5*、VP8*全长基因片段cDNA，将其重组于pET30 a表达载体，转化大肠杆菌BL21(plyss)，异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，表达产物做SDSPAGE和Westernblotting检测，目的产物用镍柱纯化。结果 ① 重组载体在IPTG诱导下，工程菌表达的两个目的蛋白主要以包涵体形式存在；②SDSPAGE检测表达产物与目的蛋白大小一致，VP5*为60 kD，VP8*为28 kD，Westernblotting检测发现两目的蛋白所带标签可与抗体反应；③镍柱纯化获得RV SA11 VP5*、VP8*蛋白，纯度达90％。结论 ①构建表达载体pET30aVP5*、pET30aVP8*;②表达、纯化VP4蛋白的VP5*、VP8*片段。

【关键词】  RV SA11 VP5* VP8* 原核表达

    Prokaryotic expression of protein VP5*，VP8*of rotavirus SA11

    JIN Linlin  LI Peng  WAN Yanzhen  et al

    Institute of Basic Medicine,Shandong Academy of Medical Science, Ji'nan  250062

    【Abstract】  Objective  To express enzyme digestion segments of VP4 protein in prokaryotic expression system.Methods  Total RNA was extracted from MA104 cell infected with rotavirus. Total length cDNA of VP5* (1587bp) and VP8*(720bp) were amplified by RTPCR. After sequencing, they were cloned into expression vector pET30a. VP5* protein and VP8*protein were expressed in E.coli BL21(plyss) induced by IPTG and analyzed by SDSPAGE and Westernblotting. VP5* protein and VP8*protein were purified by NiNTA.Results  ①VP5* and VP8* were expressed abundantly mainly in the form of incusion bodies. ②Molecular weight of expressed products is 60 kD and 88 kD analyzed by SDSPAGE. By consequence analysis of Westernblotting, we found proteins with a sixHis tag can respond to antiHis antibody.③By NiNTA purification and dialysis, we acquired proteins with more than 90% purity.Conclusion  The Rotavirus SA11 VP5* protein and VP8* protein were successfully expressed by prokaryotic expression system.

    【Key words】  RV SA11,VP5*, VP8*,prokaryotic expression

    轮状病毒(rotavirus,RV)属于呼肠孤病毒科(Reovrridase)，是引起婴幼儿和各种幼龄动物非细菌性腹泻的主要病原之一。每年有60万以上的儿童死于轮状病毒感染引起的腹泻。研究RV感染机制和抗病毒药物，是该领域重大课题之一。RV的主要抗原VP4蛋白在穿入宿主细胞过程中，可被胰酶裂解成N端片段VP8*(病毒的血凝素和重要的中和抗原蛋白)和C端片段VP5*(渗透入膜)［1］。VP4、VP5*、VP8*与细胞表面受体反应是病毒穿入细胞的关键。VP4蛋白的抗原性与VP5*、VP8*密切相关，其抗原表位位于酶切位点两侧（aa223242、aa243262）及切割位点附近（aa234251）［2］。VP5*片段在各型之间具有交叉反应性，而VP8*片段具有高度的型特异性［3］，对抗病毒药物研究、轮状病毒亚单位疫苗的研制及轮状病毒的诊断具有重要意义。本课题构建表达载体pET30a VP5*、pET30aVP8*，表达、纯化蛋白VP5*、VP8*，现报告如下。

    1   材料与方法

    1．1  细胞、毒种和载体  MA104细胞本室保存，培养液为含有10％新生牛血清的RPMI MEDIUM 1640培养液（GIBCO公司产品）。RV SA11株、宿主菌E.coli TOP10、BL21(plyss)分别引自中国CDC肠道病毒室，载体pET30a购自大连宝生物工程公司。

    1．2  VP5*、VP8*基因的扩增

    1．2.1  制备模板：MA104细胞培养至单层时接种RV SA11毒种0.5 ml，加维持液(含2％新生牛血清的1640)在35℃、5％CO2条件下培养，待细胞90％病变（5 d）时，反复冻融三次收集病毒增殖物，用Trizol试剂按说明书方法提取RNA。并用l.2％琼脂糖凝胶电泳检查总RNA的完整性、测定含量。根据OD260及OD260/OD280测定总RNA的含量及纯度。

    1．2.2  PCR方法获取目的基因

    1．2.2.1  引物设计：根据GenBank中RV SA11毒株VP4的基因全序列，从胰酶切割位点（aa247248）处设计VP4酶切片段VP5* 、VP8*的两对引物, VP5*在上游引物5' 端导入6×His标签、NdeⅠ酶切位点（CATATG），下游引物5' 端引入XhoⅠ酶切位点（CTCGAG），VP8*在上游引物5' 端导入6×His标签、NspⅤ酶切位点(TTCGAA)，下游引物5' 端引入XhoⅠ酶切位点(CTCGAG)， 引物委托北京华大基因研究中心合成。

    VP5* 上游引物： 5' CATATGCAAGCTAATGAAGATATTGTGAT3';下游引物： 5' CTCGAGCAACCTGCATTGCATAATCAG3'。VP8* 上游引物： 5' TTCGAAAATGGCTTCGCTCATTTATAGAC3'；下游引物： 5'CTCGAGAGCAGTCAACGATAATGGTA3 '。

    1．2.2.2  逆转录：各取模板RNA 5 μl，下游引物1 μl，80℃ 变性5 min后加入10×AMV Bufer 2 μl；dNTP 4 μl；Rnasin 1 μl；反转录酶AMV 1 μl；加双蒸水至20 μl，37℃逆转录1 h。

    1．2.2.3  PCR：体系（50 μl）如下：VP5* 、VP8* PCR体系相同，逆转录产物（RV cDNA）5 μl，10×PCR Bufer 2.5 μl；dNTPs(2.5 mM)2 μl；各自的上游引物1 μl；下游引物l μl；Taqplus 0.5 μl；双蒸水13 μl。反应条件: 94℃ 预变性3 min，94℃ 50 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，29个循环，72℃延伸10 min。l.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定（100 mV，30 min），DNA凝胶电泳回收试剂盒（博大泰克公司产品）回收1 587 bp、720 bp目的带。

    1．3  构建表达载体pET30aVP5*、pET30aVP8*  将回收的两个目的片段分别连接pUCMT 载体，转化Top10感受态菌株，提取VP5*质粒做NdeⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定, 提取VP8*质粒做NspⅤ和XhoⅠ双酶切鉴定，将片段连接于与相同双酶切的载体PET30a质粒，并转化BL21(plyss)感受态(卡那霉素25 μｇ／ｍｌ)，用PCR方法进行鉴定。

    1．4  目的蛋白的表达及鉴定分析 

    1．4.1  诱导表达：挑取各自单菌落接种于5 ml LB(卡那霉素25 μｇ／ｍｌ)培养液中，37℃ 培养16 h（OD600=0.8），1∶50稀释后继续培养2 h，加入终浓度0.1 mmol/L的IPTG置37℃，分别诱导表达2、3、4 h，10 000 r/min离心收集菌体待做鉴定。

    1．4.2  SDSPAGE凝胶电泳：将上述菌体进行15％ SDSPAGE凝胶电泳（电泳仪和电泳槽为上海天能产品）、Coomassie Blue染色，电泳条件（120 V，2 h）预期大小60 kD、28 kD。

    1．4.3  Westernblotting检测样品：经电转移至硝酸纤维膜，脱脂奶粉封闭，先后加鼠源抗HIS单克隆抗体、羊抗鼠IgGHRP（天根生化科技有限公司产品），反应条件均为37℃ 2 h。洗膜后加DAB显色，条带出现棕色沉淀者判为阳性。

    1．5  目的蛋白的纯化  包涵体经差速离心提取后溶于变性液（8 mol/L尿素，14.4 mol/Lβ巯基乙醇，20 mmol/L PBS），然后进入His标签镍柱纯化系统。纯化后VP5* 、VP8*蛋白经灰度扫描软件分析蛋白纯度。

    2  结果

    2．1  VP5*、VP8*基因的扩增  RTPCR扩增出的VP5*、VP8*特异性产物经琼脂糖凝胶电泳检测，1 587 bp处及720 bp处均出现完整清晰的条带，与预期目的基因大小一致。测定纯度OD260/OD280为1.8。

    2．2  构建表达载体pET30aVP5*、pET30aVP8*  重组质粒pET30aVP5*、pET30aVP8*酶切前后的产物电泳结果如图1所示，在1 587 bp、720 bp左右获得电泳带，大小与VP5*、VP8*目的基因片段长度一致（结果如图1所示）。 M：protein marker； 1：pET30aVP8*质粒经NspⅤ和XhoⅠ双酶切；2：pET30aVP5*质粒经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切

    图1  VP5*、VP8*蛋白扩增结果

    2．3  目的蛋白的表达及鉴定分析

    2．3.1  SDSPAGE 凝胶电泳：VP5*、VP8*重组蛋白在大肠杆菌 BL21(plyss)中的表达产物在细胞中以包涵体形式存在(培养上清中仅见极少量表达)经 SDSPAGE电泳、Coomassie Blue染色的结果显示(图2、3)。对于阳性克隆子，诱导表达2、3、4 h的细胞总蛋白样品VP5*在66.2 kD和45.0 kD之间均出现一条带与预期值(60 kD)相符（图2，第1，2，3泳道），VP8*在35.0 kD和24.0 kD之间均出现一条带与预期值(28 kD)相符（图3，第1，2，3泳道），未经诱导表达的细胞总蛋白样品在相应位置都没有出现着色浓重的对应条带（图2、图3，0泳道），初步证实VP5*、VP8*得到了特异性表达。将工程菌超声粉碎、离心，将上清和沉淀分别做电泳，发现沉淀中可见与目的蛋白分子量相当的电泳条带（图2、图3，第5泳道），而上清中未见上述电泳条带出现（图2、图3，第4泳道）。

    2．3.2  Westernblotting检测样品:经过Westernblotting实验显示，与预期VP5*、VP8*重组蛋白大小相符的VP5*（60 kD）片段、VP8*（28 kD）片段，可与标签抗体反应，在DAB染色下呈棕色，如图4的箭头所示。

    2．4  目的蛋白的纯化  表达产物以包涵体的形式存在，经镍柱纯化后，收集VP5*、VP8*蛋白，SDSPAGE凝胶电泳鉴定，在66.2 kD和45.0 kD及35.0 kD和24.0 kD之间出现清晰条带（图4），与预期VP5*蛋白(60 kD)、VP8*蛋白(28 kD)相符，无其他蛋白杂带。经灰度扫描分析蛋白纯度达90％。

    3  讨论

    本研究将RV结构蛋白VP4酶切片段VP5*、VP8*基因序列分别重组于pET30 a，构建了表达载体pET30aVP5*、pET30aVP8*，转化E.coli BL21感受态，诱导表达获得了两端均携带6×His标签的VP5*、VP8*融合蛋白，SDSPAGE结果提示，与预期目的蛋白VP5*、VP8*大小一致（分别为60 kD、28 kD），并与标签抗体发生特异免疫反应（Westernblotting）。用His镍柱层析方法进行纯化，灰度扫描分析得到的蛋白纯度均可达90％。

    本课题通过与前期表达RV结构蛋白VP4工作比较发现，VP4、VP5*、VP8*蛋白原核表达实验条件一致，时间对三种蛋白的表达量均无明显影响，原核表达此三种蛋白在细胞中主要以包涵体形式存在。但相同诱导表达条件下获得的VP8*蛋白量明显高于VP4、VP5*蛋白，用ANTHEPROT5.0软件分析发现VP4蛋白的疏水氨基酸主要集中在C端，导致了在同一诱导表达蛋白的实验条件下，表达获得的蛋白量的差异。VP4蛋白酶切片段通过与细胞膜上四种(包括神经节苷酶GM1、GM2、唾液酸SA、整合素αⅱβ1 、αvβ3、αⅩβ2、以及热休克蛋白70 家族的Hsc70)结合，介导病毒的吸附、穿入细胞［3］，如：神经氨酸酶敏感型RV通过VP8*识别SA受体，而有些毒株利用α2β1作为结合位点。VP5*片段与整合素（α2β1的α2Ⅰ）、分子伴侣Hsc70相互作用［4］。本课题组进行抗病毒药物机制研究则需明确药物与VP4、VP5*、VP8*蛋白中哪一个或者哪几个作用发挥抗病毒效果。

    本课题组在一株真菌中获得抗病毒组分对RV体内抗病毒活性较为显著［5］，并且初步认为其抗病毒机制为与病毒表面蛋白作用阻断了病毒的穿入过程［6，7］，所以本课题用原核系统克隆表达RV SA11穿入相关蛋白（VP4、VP5*、VP8*），并将其用于干预药物与病毒的作用过程，通过体外抗病毒试验（细胞病变法），将可能阐明药物阻断RV穿入宿主细胞的分子机制，阐明药物抑制病毒穿入的分子靶点，为药物走向临床奠定基础。

    目前，国内仅见刘馨等［8］表达RV SA11 VP4全长并用亲和层析纯化蛋白进行免疫原性方面研究，国外仅见表达人RV、牛RV的VP4蛋白片段及VP8*用于诊断及疫苗研制方面研究，如国外Nolan等［9］利用pGEX4T 2 GST载体表达人RV WA株VP4的GST融合VP8，Favocha等［10］利用pET28a(+)载体表达牛RV C486株VP4的酶切片段VP8，Mahajan等［11］原核表达了含有麦芽糖结合蛋白的人轮状病毒P4G2型VP4融合蛋白。均未见表达RV SA11 VP4全长及其酶切片段（VP5*、VP8*）采用镍柱纯化用于确定抗病毒活性物质抑制病毒穿入的分子靶点确定方面的研究。所以我们在克隆表达的RV SA11 VP4全长蛋白的基础上，同时用原核系统克隆表达了RV SA11 VP4蛋白酶切片段VP5*、VP8*，进一步研究VP4、VP8*、VP5*与抗病毒药物之间的相互作用，将有可能为研发低毒、高效的病毒融合蛋白阻断剂类抗RV药物奠定物质基础。

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［9］ Nolan KJ, Sasaki E, Yoo D,et al. Cloning and expression of human rotavirus spike proteinVP8 * in Escherichia coli［J］.Biochem Biophys Res Communt，2001, 282: l1831188.

［10］ Favocha AR, Kurtenbach , Sardi S,et al. Cloning expression and purification of recombinant bovine rotavirus hemagglutinin, VP8*, incherichia coli［J］.Pro Expr Purif, 2006, 46(2): 196203.

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作者单位：山东省医学科学院基础医学研究所 济南市 250062