Survivin mRNA在肾透明细胞癌组织和外周血中表达的研究

【摘要】  目的 探讨Survivin mRNA在肾透明细胞癌(renal clear cell carcinoma，RCCC)患者组织和外周血中的表达及其意义。方法 采用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）法检测46例RCCC患者肿瘤组织和15例健康志愿者外周血细胞中Survivin mRNA表达情况。结果 46例RCCC患者中有21例外周血细胞Survivin mRNA阳性表达，表达率为45.7％。对照组15例中有2例Survivin mRNA阳性表达，阳性率为13.3％，RCCC组Survivin mRNA阳性率明显高于对照组（P＜0.05）。46例RCCC患者同时收集到肿瘤组织和外周血，Survivin mRNA阳性表达分别为63.0%和45.7%，两者具有相关性（P＜0.01）。结论 Survivin mRNA在RCCC肿瘤组织中有显著的阳性表达，应用RTPCR法检测外周血细胞Survivin mRNA的表达，诊断RCCC敏感性、特异性高，且创伤性小，因此Survivin mRNA有可能成为RCCC诊断的一个新的敏感指标，是目前进行肿瘤早诊的理想检测方法之一。

【关键词】  肾透明细胞癌 Survivin 逆转录聚合酶链反应 外周血

    Expression and clinical significance of Survivin mRNA in tumoral tissues and blood of patients with RCCC

    WANG Jianwei

    Department of Urology，Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College,Qingdao 266003

    【Abstract】  Objective  To study the expression and significance of Survivin mRNA in tumoral tissues and blood cells of patients with renal clear cell carcinoma（RCCC）.Methods  Survivin mRNA in tumoral tissues of 46 patients with RCCC, 15 normal renal tissues, blood cells of 46 patients with RCCC, and 15 healthy volunteers were detected. Survivin and βactin were amplified by using RTPCR.Results  21 cases (45.7%) showed positive Survivin mRNA signals in blood in patients with RCCC. Only 2 patiemts (13.3%) in control group showed positive Survivin mRNA signals in blood. The expression of Survivin mRNA difference between experimental group and control group was significant (P＜0.05).The positive rates of Survivin mRNA in tumor tissue and blood were 63.0% and 45.7% ,respectively (P＜0.01).Conclusion  Carcinoma tissues of the patients with RCCC showed significantly positive expression of Survivin mRNA. High sensitivity and the specificity of expression of blood Survivin mRNA to provide a simple, microinvasive diagnostic test to identify patients with RCCC .RTPCR  was an effective method for detection of Survivin mRNA in the blood of patients with RCCC.

    【Key words】  renal clear cell carcinoma, Survivin,RTPCR,peripheral blood

    肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤，占泌尿外科肿瘤的第二位，其患病率占全身恶性肿瘤的3%［1］。根据病理分类，肾细胞癌又分为透明细胞癌、乳头状癌、颗粒细胞癌及未分化癌等几种类型，其中大多数为透明细胞癌(renal clear cell carcinoma，RCCC)，约占总数的67.6%～76.2%［1］。目前对于肾癌尚无特殊有效的治疗方法，传统临床治疗中远期效果均不理想，因此早期诊断对RCC的预后至关重要，发现敏感性和特异性均理想的肿瘤标记物对此有着极为重要的意义。目前关于Survivin在RCC中表达的报道甚少，其与肾癌临床病理特征的关系尚无公认的结论，且Survivin在RCC患者外周血中的表达情况能否成为一种潜在的瘤标，尚未见报道。本研究采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)法分别检测RCCC患者组织和外周血中Survivin mRNA的表达情况，评价其临床意义，以期找到更为有效的诊断、治疗和判断RCCC预后的指标。

    1  资料与方法

    1.1  临床资料  实验组：收集2006年1月—2007年12月我院诊治RCCC患者46例，年龄42～78岁，平均62.7岁；男27例，女19例；左侧25例，右侧21例； 均经临床及病理证实。病理分级按WHO标准，G1 11例，G2 21例，G3 14例。同时留取该46例RCCC患者的外周血，患者采血前未经任何治疗。对照组：15例健康人外周血做为对照组。

    1.2  实验方法

    1.2.1  实验材料的处理和保存：所有RCCC组织标本取下后立即以液氮速冻，并转移至－80℃保存待用。所有外周血取3 ml，EDAT抗凝，3 000 r/min，离心20 min，弃血浆转入1.5 ml EP管，-80℃保存备用。

    1.2.2  RNA的提取：采取Trizol法制备样品总RNA。

    1.2.3  RNA的测定：用紫外分光光度计对RNA在260 nm和280 nm下的吸光度A260和A280进行定量，计算OD260/OD280。RNA完整性的测定：秤琼脂糖1 g，加入1×TAE到总体积为50 ml，配成2%的凝胶，经微波炉加热100 s左右，冷却到微烫手时加入 2.5 μl EB(0.5 μg/μl)充分混匀后灌胶。取RNA溶液3 μl，加2 μl 1×TAE，1 μl 6×Loading Buffer，混匀后上样。在1×TAE的电泳液中，以5 V/cm的电压电泳20 min，在紫外灯下观察RNA的电泳带，比较核糖体RNA（rRNA）28 s和18 s两条带，如果在EB作用下显色强度为2∶1，说明本实验提取的RNA比较完整。

    1.2.4  逆转录合成：10 μl反应体系，按照设计盒说明配制。反应条件：30℃ 10 min，45℃ 30 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min。产物－20℃保存待用。

    1.2.5  PCR扩增：50 μl反应体系配置：在上述10 μl逆转录产物中依次加入：反应条件：94℃ 2 min灭活逆转录酶；94℃变性45 s,54℃ 退火30 s,72℃ 延伸60 s,35个循环；72℃ 延伸10 min。反应完成后将产物－20℃保存待用。

    1.2.6  琼脂糖凝胶电泳：制备2%琼脂糖凝胶，于100 V稳压条件下电泳45 min，在VILBER LOURMAT 凝胶成像仪上观察并拍照。电泳结果判断：出现270 bp电泳带为HPSE mRNA阳性，标本均选βactin为PCR反应内参标准。

    1.2.7  ELlSA反应：按照RTPCR试剂盒操作说明书进行。

    1.3  统计学方法  应用 SPSS12.0 统计软件进行分析，统计学分析方法采用非参数统计中χ2检验、Spearman等级相关进行统计分析，P＜0.05 为有统计学意义。

    2  结果

    2.1  Survivin mRNA在正常肾脏组织和肿瘤组织中的表达  46例RCCC患者肿瘤组织和15例正常肾脏组织中Survivin mRNA表达见表1。RCCC组与对照组比较具有显著统计学意义（P＜0.01）。表1  Survivin mRNA在正常肾脏组织和肿瘤组织中的表达标本分组nSurvivin mRNA 表达阳性例数阳性率

　　2.2  Survivin mRNA 在外周血中的表达情况  46例RCCC患者及15例对照组Survivin mRNA的表达情况见表2。其中RCCC患者外周血细胞Survivin mRNA阳性表达率为45.7%(21/46),对照组中2例Survivin mRNA为阳性，表达率为13.3%(2/15)，两者比较有统计学差异（P＜0.05）。虽然肿瘤组织较外周血细胞中Survivin mRNA表达高，但两者表达统计具有相关性（P＜0.01），说明两者表达具有相关性。表2  Survivin mRNA在正常和肿瘤患者外周血中的表达外周血

　　3  讨论

    Survivin是迄今发现的最强的凋亡抑制因子［3］，现认为Survivin主要以三种方式直接或间接抑制caspase活性而抗凋亡：①Survivin直接结合caspase9；②Survivin封闭辅助性线粒体源性caspase激活因子（SMAC）保护凋亡蛋白抑制（IAP）家族成员免受其抑制；③Survivin增强IAP家族成员对抗SMAC作用［4］。此外最近研究还表明：①Survivin还可通过对纺锤体微管的作用调节细胞有丝分裂的过程，进而发挥其抗凋亡的功能。 Survivin与bcl2等凋亡抑制因子具有协同效应，其还参与了p53依赖凋亡途径，从而通过多种机制抑制细胞凋亡［5］。Survivin主要的生物功能有［6］：①参与细胞周期调控；②抑制肿瘤细胞凋亡；③参与微管形成等。Survivin的分布具有明显的组织细胞选择性。Survivin存在于人的各种胚胎组织中，除胸腺和生殖腺外，在人的正常分化成熟的组织检测不到Survivin的表达［7］，而当细胞发生转化或者细胞恶变时又重新获得表达［8］。

    本研究中，对46例RCCC患者和15例正常对照组外周血进行Survivin mRNA检测，结果显示RC 噬细胞的数量, 减轻肺组织炎症细胞的浸润，降低AM中TNFα、IL8、NO和TGFβ1等的表达水平，抑制肺泡巨噬细胞和纤维母细胞的活化，从而减轻肺组织炎症，使细胞外基质合成减少，进而抑制了肺纤维化的发生发展。随着对细胞因子网络在肺纤维化中作用机制研究的不断深入，细胞因子抗体及反义寡核苷酸技术的发展将对肺纤维化的治疗提供新的治疗方法。

【参考文献】
  ［1］ Crystal RG, Bitterman PB, Rennard SI,et al. Interstitial lung diseases of unknown cause: disorders characterized by chronic inflammation of the lower respiratory tract［J］. N Engl J Med， 1984，310：154166.

［2］ Kelly M, Kolb M, Bonniaud P,et al. Reevaluation of fibrogenic cytokines in lung fibrosis［J］.Curr Pharm Des，2003，9（1）：3949.

［3］ 肖永久,朱运奎,汤育瑛,等. 地塞米松对博莱霉素致大鼠肺纤维化胶原含量的影响 ［J］. 西北国防医学杂志，2005，26(3)：203205.

［4］ 周彩存,袁淮平,许启霞,等. 糖皮质激素对肺间质纤维化的治疗作用［J］. 蚌埠医学院学报, 2000，25(2): 8485.

［5］ Piguet PF，Collart MA, Grau GE,et al. Tumor necrosis factor/cachetin plays a key role in bleomycininduced pneumonia and fibrosis［J］. J Exp Med,1989,190(3)：655.

［6］ 韩文铭, 何丽娜, 董燕,等. 中性粒细胞与IL8在特发性肺间质纤维化中的作用［J］. 临床内科杂志, 2002，19(2): 144145.

［7］ Romanska HM, Polak JM, Coleman RA,et al. iNOS gene upregulation is associated with the early proliferative response of human lung fibroblasts to cytokine stimulation［J］. J Pathol， 2002，197：372379.

作者单位：青岛大学医学院附属医院泌尿外科 青岛市 266003