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【关键词】 青光眼；视网膜节细胞；激光凝固；巩膜上静脉
青光眼是仅次于白内障的第二大致盲眼病，但是其机制目前尚不清楚，目前有多种学说解释青光眼的视神经损伤，其中比较公认的是机械学说、缺血学说、遗传学说等，但都不能完全揭示青光眼的发病机制，所以青光眼模型的建立方法各异。其中增高动物眼压是最常用的建立模型的方法，眼压升高可以导致视网膜中央动脉对视网膜内层供血不足，导致缺血缺氧、自由基形成、兴奋性中毒等，从而导致视网膜节细胞不可逆损伤，这也是青光眼的最终病理现象。目前尚无两种青光眼模型的比较报道，我们着重研究两种青光眼模型导致视网膜病理变化的比较，试图发现两种模型的区别，指导其应用，报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物 健康、成年雄性SD大鼠（烟台绿叶制药公司）50只，体重200～300 g。将大鼠随机分为五组：正常对照组10只，光凝小梁网模型组10只，光凝小梁网假手术组10只，烙闭巩膜上静脉组10只，烙闭巩膜上静脉假手术组10只，均于右眼建立模型或假手术。
1.2 模型建立
1.2.1 光凝小梁网模型：4％水合氯醛（1 ml/100 g）腹腔麻醉大鼠，1%利多卡因滴眼，激光参数为功率0.4 W，光斑直径200 μm,持续时间0.7 s，激光直接射入小梁网，旋转大鼠使激光以锐角直接照射小梁网，每眼一周光凝90个点左右［1］。光凝两次，间隔4 d，第10天眼压超过20 mm Hg认为建立模型成功。假手术组用相同参数激光环形照射角膜避开小梁网。
1.2.2 烙闭巩膜上静脉模型：4％水合氯醛（1 ml/100 g）腹腔麻醉大鼠，1%利多卡因滴眼后固定在手术台上, 沿角膜缘剪开球结膜，分离巩膜上静脉，烧热大头针烙闭至少3条静脉及其附近静脉丛，远端静脉缺血变白，近端静脉充血说明手术成功，术后涂抗生素眼药膏，术后7 d每天0.5%氯霉素眼药水滴眼［2］。假手术组操作同上，只是烧热针头避开巩膜上静脉。
1.3 显微镜观察 按预先分组在第7天断头处死大鼠，迅速摘除眼球，亚甲蓝标记角膜上极及视神经短端。角膜上扎一小孔，浸润于4％中性甲醛中固定24 h，将固定好的眼球通过角膜上极和视神经断端对称剖开眼球，梯度酒精脱水，浸蜡，常规石蜡包埋，连续4 μm切片，常规苏木精伊红染色。采用摄像显微镜观察并照相，测量高倍视野内视乳头周围1 mm处视网膜各层厚度并计数300 μm视网膜节细胞数目［3］。
1.4 统计学分析 实验数据以x±s表示，采用单因素方差分析，P＜0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 视网膜各层厚度及形态观察 正常对照组大鼠视网膜各层结构完整，排列整齐（图1）。光凝小梁网模型组大鼠视网膜节细胞层（GCL）水肿结构松散，内丛状层（IPL）厚度变薄并出现空泡，内核层（INL）厚度变化不明显，但个别细胞核固缩，外丛状层（OPL）厚度无明显变化，外核层（ONL）厚度无变化，细胞核正常，排列整齐（图2）。其中，IPL厚度与高眼压模型假手术组比较具有显著性减少（P＜0.05）；假手术组视网膜各层与正常对照组相似，结构完整，排列整齐。烙闭巩膜上静脉组与高压模型组类似大鼠视网膜GCL松散，IPL变薄，INL厚度变薄且细胞减少，OPL厚度略变薄；ONL细胞略减少，但细胞核排列整齐（图3）；假手术组大鼠视网膜GCL水肿不明显，细胞核排列较整齐，其中IPL、INL、ONL厚度与假手术组比较均明显减少（P＜0.05），细胞核无固缩，排列整齐。
2.2 视网膜节细胞观察 正常对照组大鼠视网膜节细胞排列紧密整齐，细胞核均匀深染，胞核大小一致。光凝小梁网组大鼠视网膜节细胞排列稀疏且不规则，细胞核固缩，有些出现空泡、碎裂，部分细胞核溶解，细胞核大小不一，与假手术组比较显著减少（P＜0.05）；假手术组与正常对照组视网膜节细胞相似，排列整齐，胞核大小一致，均匀深染。烙闭巩膜上静脉组视网膜节细胞排列疏松，部分节细胞出现核固缩，染色加深，胞核大小不一，与假手术组节细胞数目相比明显减少（P＜0.05）； 假手术组视网膜节细胞相比无明显差异，节细胞排列整齐，胞核染色均一，大小一致。
3 讨论
本实验通过制作光凝小梁网和烙闭巩膜上静脉两种青光眼模型，研究了不同原理导致的视网膜节细胞损伤，比较其损伤的不同，进而明确两种模型的优缺点。
本研究使用的是光凝小梁网形成慢性眼压升高，可以形成类似临床青光眼的高眼压，从实验结果可发现此法导致的高眼压可使视网膜节细胞显著减少，内丛状层厚度变薄，内核层和外核层无明显变化，非常符合临床青光眼的病理表现，本模型方法制作简单，实验周期短，是研究高眼压视神经损伤的理想模型。有学者［4，5］采用前房注射α糜蛋白酶等方法升高眼压，但在实验过程中眼压升高不易控制，操作困难，眼压升高持续时间短，较光凝小梁网法有明显缺点。该法炎症反应轻且持续时间短，以改变房水流出道导致眼压升高持续稳定［6］。高眼压导致的视网膜损伤的机制很多，其中以高压导致视网膜缺血和高压直接导致视网膜损伤为主。视网膜缺血后组织学变化与缺血的时间、程度及细胞的状态都有关系，所以在研究结果上有差异。一般在早期以水肿为主，晚期表现为细胞的变性、萎缩及死亡。视网膜缺血损伤的机制非常复杂，一般认为细胞内钙超载、兴奋性氨基酸中毒、细胞因子、自由基的损伤等多种因素参与了视网膜损伤的过程，其中自由基的连锁反应和细胞内钙超载是导致视网膜节细胞凋亡的关键［7～9］。高压直接导致的视网膜损伤主要是由于对视网膜节细胞轴突产生机械压迫，导致视网膜节细胞凋亡，其机制可能是视神经阻断后轴浆运输中断，细胞失去靶细胞分泌的下行神经微丝蛋白调节，使原癌基因表达发生变化，导致细胞凋亡，细胞数量减少［10］。有学者报道［11］培养的视网膜节细胞在高压下也可导致细胞的凋亡，其机制尚不明确。
本实验所用的另一种方法是烙闭巩膜上静脉，可阻断房水的引流，导致眼压升高，其导致视网膜的损伤机制与光凝小梁网导致视网膜损伤机制相似，也是由于视网膜缺血和视网膜节细胞轴浆运输阻断等。但此法导致的眼压升高不稳定且持续时间短，并且操作技术要求高，模型成功率低。从实验结果来看，使视网膜节细胞减少的数目更明显，而且内丛状层、内核层和外核层厚度均明显变薄，可见此法易导致视网膜全层损伤，可能是由于本方法的损伤和感染导致的。
两种方法比较，烙闭巩膜上静脉建立模型技术要求较高，且容易出现高眼压以外的原因导致视网膜损伤，本方法导致的眼压升高只能持续2周；光凝小梁网建立模型技术简单，感染轻，高眼压持续时间长且稳定。由此可见，光凝小梁网建立青光眼的模型是一种比较好的研究慢性青光眼机制的模型。
【参考文献】
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作者单位：滨州医学院 滨州市 256603