新鲜人羊膜负载构建兔角膜上皮

【摘要】  目的 新鲜人羊膜负载构建兔角膜上皮，为全角膜组织工程作基础。方法 采用组织块法培养兔角膜缘干细胞，以新鲜人羊膜为载体，形成单层细胞膜片后用于传代；采用相差显微镜进行形态观察及AE5、p63免疫荧光鉴定。结果 培养24 h，兔角膜缘组织块边缘可见有细胞长出，之后形成“沙滩样”移形带，培养至7～8 d细胞在羊膜上形成单层膜状，细胞透明，边缘整齐，形态呈多样化，以卵圆形和多边形为主；AE5抗体、p63抗体染色阳性细胞比例分别为（41.72±11.35）%、（21.57±6.36）%；2代AE5和p63阳性细胞比例与原代比较，无显著性差异（P﹥0.05）；3代AE5和p63阳性细胞比例与原代比较，差异有统计学意义（P﹤0.05）；但4代AE5阳性细胞比例又明显升高。结论 以新鲜羊膜为载体、采用组织块法培养角膜缘干细胞可获得较好的角膜上皮片，在传代细胞中，3代细胞分化程度最低、增殖能力最强，最适合移植。

【关键词】  角膜缘干细胞；新鲜羊膜；细胞培养

Cultivation of rabbit limbal stem cell on human fresh amnion

    HU Jian  WANG Qiang  LEI Ningyu  et al

    Department of Ophthalmology, Affiliated Hospital of Binzhou Medical University，Binzhou 256603

    【Abstract】  Objective  To produce rabbit corneal epithelium with cultivation of rabbit limbal stem cell on human fresh amnion.Methods  Rabbit limbal epithelium was cultured on human fresh amnion by tissue block method. It was passage time when the primary cells formed monolayer cell patch. Keratin 3(AE5) and p63 were detected on the primary and four generation  cells with immunofluorescence. Contrast phase microscope was used to observe the appearance of cells.Results  Cells outgrew from the limbal tissue block within 24 hours, then ‘sandy beach’ band formed, and confluent monolayer cell patch appeared when cultivated 7～8 days. The positive percentage of AE5 and p63 was (41.72±11.35)% and (21.57±6.36)% respectively in primary cells. Positive percentages of AE5 and p63 were no of statistical difference between the second generation cells and primary cells (P﹥0.05), while there was significant difference between the third generation and primary cells(P﹤0.05), and AE5 positive cells increased in the fourth generation.Conclusion  Corneal epithelium is produced with cultivation of rabbit limbal stem cell by method of tissue block on human fresh amnion. Among all generations, the third generation cells are most suitable to be translated, because of the lowest differential degree and the strongest proliferative ability.

    【Key words】  limbal stem cells，fresh amnion，cell culture

    组织工程构建角膜上皮是组织工程化全角膜的课题之一。角膜缘干细胞是角膜上皮细胞增殖、分化和移行的来源，目前这一观点已经得到公认。种子细胞问题解决后，载体的选择已成为研究重点。本课题组采用新鲜羊膜负载培养角膜缘干细胞，为角膜上皮组织工程的载体选择提供参考。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  组织来源：兔眼取自健康纯系新西兰大白兔，雌雄不限，体质量2～2.5 kg，由重庆医科大学动物中心提供，在实验前用0.25％氯霉素滴眼液点眼，4次/日，共3 d。羊膜取自排除肝炎病毒、AIDS病毒及梅毒等传染病的剖腹产妇的胎盘。

    1.1.2  主要试剂：DMEM/F12培养液、胎牛血清（美国Hyclone公司），鼠抗兔单克隆AE5抗体（K3抗体）、鼠抗兔单克隆抗体p63（英国Abcam公司），免疫荧光染色试剂盒（Sigma公司），硝酸纤维素膜（北京鼎国生物制品公司），青霉素、链霉素、庆大霉素（上海生物工程技术服务有限公司）。

    1.1.3  主要仪器：相差显微镜(Likon UFXⅡ型，OLYMPUS日本)，CO2培养箱(2300型SHELDON美国)，眼科显微手术器材等。

    1.2  方法

    1.2.1  新鲜羊膜的制备：①羊膜取材：含抗生素（4 000 U/ml的庆大霉素、青霉素500 U/ml、链霉素500 μg/ml）PBS洗去胎盘的血凝块，钝性剥离羊膜，使其与绒毛膜分离，同时用含抗生素的PBS冲洗干净后浸泡20 min，上皮面朝上平铺于硝酸纤维素膜上。将上述附有羊膜的纸片修剪成2.5 cm×2.5 cm的小块。PBS冲洗2次，置于细胞培养板中DMEM/F12培养液（含100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素，无血清）浸泡备用，所制羊膜均于取材后12 h内使用。②羊膜去上皮：含0.25%胰蛋白酶和0.01%EDTA的消化液37℃消化40 min，用细胞刮刀轻轻刮除上皮细胞，PBS清洗2次，相差显微镜下确认上皮细胞全部清除。上皮面朝上铺于盖玻片（22 mm×22 mm）上置于6孔培养板内。

    1.2.2  兔角膜缘干细胞的原代培养（组织块法培养）：空气栓塞处死白兔，无菌条件下摘除眼球，去除角膜缘周围的附属组织，用含抗生素的PBS清洗3次，切取角膜缘组织，剪成1 mm3组织块。用含0.25%胰蛋白酶和0.01%EDTA的消化液消化15～20 min)，500 r/min离心后，弃去消化液，PBS清洗2次，将组织块置于羊膜上，每孔3块，间距0.5 cm，无菌静置10 min。含100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素和20%胎牛血清的DMEM/F12培养液，37℃、5%CO2培养，3 d换液，之后每2 d换液1次，形成单层细胞膜片后用于鉴定或传代。

    1.2.3  角膜缘干细胞的传代纯化：相差显微镜下观察，待组织块生出的细胞形成单层膜片后，一般为8 d左右，将组织块取出置于另一羊膜上继续培养。PBS洗涤2次，0.25%胰蛋白酶37℃消化2～3 min，含血清细胞培养液中止消化，轻轻吹打下的细胞收集入离心管，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入细胞培养液制成细胞悬液，调整浓度至1×105copies/ml，接种于羊膜上，隔日换液，每2 d换液1次。如此传代3次，去除纤维细胞。待细胞基本长满后用于鉴定和移植。

    1.2.4  角膜缘干细胞的鉴定［１］：免疫荧光鉴定：吸尽培养液，加入1 ml固定液，固定10 min。去固定液，用洗涤液洗3次，每次3～5 min，吸尽液体。用封闭液封闭60 min，在摇床上轻轻摇动。去封闭液，用稀释的一抗作用60 min，可以在摇床上轻轻摇动。4℃作用过夜。去除一抗，用洗涤液洗涤3～5次，每次3～5 min。去除洗涤液，加入1 ml稀释好的荧光标记的二抗作用60 min，可以在摇床上轻轻摇动。回收荧光标记的二抗，用洗涤液洗涤3～5次，每次3～5 min。滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，尽量避免气泡。使细胞接触封片液，在荧光显微镜下观察荧光。

    1.3  统计学方法  本实验数据均使用SPSS14.0统计软件进行分析，传代细胞与原代细胞AE5和p63抗体染色阳性比例间比较采用χ2检验，P﹤0.05为差异有统计学意义。

    2  结果

    2.1  角膜缘干细胞原代培养与鉴定  相差显微镜下观察，在羊膜上培养24 h，兔角膜缘组织块边缘可见有细胞爬出（图1），大多为圆形、透明状。之后形成“沙滩样”移形带，培养至7～8 d细胞形成单层膜状（图2），细胞透明，边缘整齐，形态呈多样化，以卵圆形和多边形为主。若继续培养至14 d左右，细胞成复层生长。

    2.2  采用免疫荧光法鉴定原代培养的干细胞  AE5抗体染色阳性细胞质呈红色，阴性则不着色（图3）；p63抗体染色阳性细胞核呈绿色（图4）。羊膜上培养7 d的细胞AE5抗体阳性细胞比例为（41.72±11.35）%，p63抗体染色阳性细胞比例为（21.57±6.36）%。具体见表1。

    2.3  传代纯化的角膜缘干细胞鉴定  经传代培养，与组织块原代培养时相比，相差显微镜下观察细胞形态较规整，成纤维状细胞明显减少（图5）。经免疫荧光鉴定，2代AE5和p63阳性细胞比例与原代比较，无显著性差异（P﹥0.05）；3代AE5和p63阳性细胞比例与原代比较，差异有统计学意义（P﹤0.05），AE5阳性细胞数明显减少（图6），p63阳性细胞数增多（图7）；但4代AE5阳性细胞比例又明显升高。见表1。 表1  原代与传代角膜缘干细胞免疫荧光染色结果比较

    3  讨论

    组织工程化角膜是解决角膜移植供体来源最有前途的一个方法。载体是构建组织工程化角膜上皮的关键环节，合适的载体应可以促进体外角膜缘干细胞的生长，同时又便于培养的细胞移植。羊膜为胎盘最内层的半透明组织，研究表明，其作为角膜缘干细胞体外培养的载体并用于移植有许多优点：①能为正常角膜上皮生长、移行创造良好的条件。羊膜是人体中最厚的基底膜，含有高浓度的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)和糖蛋白，有利于上皮细胞的分化、移行，并能加强基底上皮细胞的附着和防止上皮细胞凋亡。②免疫原性弱。羊膜不含HLAA、B、C及DR等抗原成分，移植后不被宿主排斥，且在体内可降解［２］。③移植后可以阻止结膜化的发生。羊膜可诱导转化生长因子（TGF）β等细胞因子在创伤愈合中与成纤维细胞活动有关的信号下调，从而达到抗纤维化效果，减轻瘢痕形成。其中，TGFβ3还是干细胞生长的重要因子。④具有抗微生物特性，因此可降低移植术后感染的发生率。⑤羊膜还具有活跃的物质转运功能，能允许一些小分子物质如尿素、葡萄糖等通过。⑥羊膜来源广泛，制备成本低。以上特点使羊膜被认为是工程化角膜上皮的最佳载体［3］。本课题组采用去除上皮细胞的新鲜羊膜作为载体培养角膜缘干细胞，与其他文献报道相比，细胞生长速度较快，24 h即可见有细胞长出，7～8 d汇合成单层膜状。这可能与所用羊膜均为取材后12 h内，与干细胞生长相关细胞因子含量丰富有关。

    目前对角膜缘干细胞标志物的研究已取得了一定的进展，但仍然缺乏具有特异性的标志物。Schermer等［４］的研究表明，K3蛋白是角膜上皮终末分化的标志性角蛋白，未表达K3是角膜缘干细胞的标志之一。Pellegrini等［５］证实角膜缘基底细胞抗p63抗体阳性，其他部位均阴性；能形成全克隆的细胞是干细胞，而全克隆细胞p63抗体阳性，故认为p63是角膜上皮干细胞的特异标志之一［６］。所以我们采用AE5抗体（K3抗体）和p63抗体行免疫荧光鉴定所培养细胞。本实验原代培养7 d羊膜上的细胞膜片中AE5阴性细胞较多，说明角膜缘组织块原代培养可获得维持于低分化状态的干细胞；而p63阳性细胞较多则说明细胞增殖能力很强。以新鲜羊膜为载体采用组织块法培养角膜缘组织可得到含角膜缘干细胞的细胞膜片。3代AE5阴性细胞和p63阳性细胞比例明显高于原代。

    但是实验过程中发现，角膜缘组织原代细胞中混杂有成纤维状细胞和其他分化成熟的细胞，且增殖速度高于角膜缘干细胞，培养超过2周则载体全被成纤维状细胞覆盖。因不同细胞贴壁程度不同，因此我们利用不同的消化时间将培养细胞传代克隆化，尽量去除成纤维状和其他杂细胞。结果表明，夹杂于干细胞间的成纤维状细胞明显减少。而且在本实验条件下，原代细胞浓度为1×105copies/ml传代，3代AE5阴性细胞和p63阳性细胞比例最多，角膜缘干细胞纯度最高。但传代超过4代，角膜缘干细胞大部分同时表达AE5和p63，说明干细胞已经出现分化。

【参考文献】
  ［1］ 韩晓洁,龚岚,余振钰,等.人角膜缘干细胞的体外原代培养和生物学鉴定［J］.解剖科学进展,2005，11(1)：13.

［２］　Schwab IR.Cultured corneal epithelia for ocular surface disease［J］.Trans Am Ophthalmol Soc, 1999, 9(7): 891986.

［3］ 夏凉,赵敏.角膜缘干细胞培养的载体研究概况及进展［J］.中国实用眼科杂志,2005,23(12):12651268.

［4］ Schermer A, Galvin S, Sun TT．Differentiationrelated expression of a major 64K corneal keratin in vivo and in culture suggests limbal location of corneal epithelial stem cells［J］．J Cell Biol, 1986, 103(1): 4962.

［5］ Pellegrini G, Dellambra E, Golisano O,et al.p63 identifies keratinocyte stem cells［Ｊ］．PNAS，2001，98：31563161.

［6］ Du YQ．Functional reconstruction of rabbit corneal epithelium by human limbal cells cultured on amniotic membrane［Ｊ］．Molecular Vision，2003，9：635643.

作者单位：滨州医学院附属医院眼科 滨州市 256603