阿霉素小鼠肾病模型的建立及IL18结合蛋白干预的实验研究

【摘要】  目的 建立阿霉素小鼠肾病模型并探讨IL18结合蛋白(IL18BP)通过结合内源性IL18对该模型的干预机制。 方法 昆明种小鼠30只，随机分为正常对照组、阿霉素肾病造模组（ADRMCN组）、IL18结合蛋白治疗组（IL18BP治疗组）3组，用阿霉素7.5 mg/kg尾静脉注射进行造模，治疗组于第5、7、12、21天腹腔注射0.5 mg/kg剂量mIL18BP（鼠源性IL18结合蛋白），隔周检测尿蛋白一次，观察并记录其生命体征；42 d后心脏采血处死小鼠，分离血清ELISA法检测相关细胞因子和生化指标。结果 ①ADRMCN组24 h尿蛋白定量（UPE）明显升高，与正常对照组及IL18BP治疗组相比均有显著性差异（P＜0.01）。②ADRMCN组血清中甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）显著高于正常对照组、IL18BP治疗组（P＜0.01），总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）显著低于后两者（P＜0.01），尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）含量各组间无显著性差异（P＞0.05）；③IL18BP治疗组血清IL18水平比ADRMCN组明显降低（P＜0.01），且与24hUPE呈显著正相关（r=0.708，P＜0.01）。结论 ①昆明鼠微小病变性肾病模型建立。②IL18BP可通过特异性结合内源性IL18抑制其下游致炎因子的释放，对阿霉素肾病模型发挥干预作用，从而调节免疫平衡，改善肾脏功能。

【关键词】  微小病变型肾病综合征；阿霉素；IL18；IL18结合蛋白

Experimental study of  IL 18 BP treatent in ADRinduced mice model of MCN

    DONG Menghua1  LIU Zhixue2  MENG Xianghui3  et al

    1 College of Basic Sciences, Binzhou Medical university,Binzhou 256603;2 College of integrated Chinese and

    Western Medicine,Binzhou Medical University;3 Department of Surgery,People′s Hospital of Gaoqing

    【Abstract】  Objective  To explore the experimental therapeutic effect machanism of IL18BP through binding endogenous IL18 on ADRinduced nephropathy in mice.Methods   The 30 KunMing mice were divided into 3 groups  randomly:Blank group,Model group（ADRMCN group）and Therapy group(IL18BP group). The Model and Therapy group were induced to nephropathy model by single injection of ADR (7.5 mg/kg) through tail vena，and then the mice of Therapy group were treated with mIL18 Binding Protein (mIL18BP) with 0.5 mg/kg on day 5,7,12 and 21. Protein in uria was measured biweekly and objective sign of mice was recorded. All mice were sacrificed through getting blood from the heart on the 42 th day ater the first injection of ADR.Correlative cytokine and biochemical parameters were detected in serum.Results  ①The 24hUPE of IL18BP treated groups was significantly decreased as compared with that in ADR-MCN group, but still was significantly increased as compared with that in normal control（P＜0.01）.②In ADRMCN group, the levels of TG and TC were higher and TP and ALB were lower than those in IL18BP theated groups in serum（P＜0.01）.The levels of BUN and Scr had no  significant difference（P＞0.05）.③ In IL18BPtreated groups ,the level of IL18 in serum was significantly decreased as compared with that in ADRMCN group（P＜0.01） and  positively correlated with 24 hUPE.Conclusions  ①ADR Nephropathy Model induced. ②IL18BP has obvious therapeutic effect to ADR nephrosis mice through specifically binding IL18,regulating immunologic balance,strengthening renal funtion.

    【Key words】  MCN, ADR,IL18,IL18BP

    微小病变型肾病综合征（MCN）发病机制至今仍未完全阐明。大量研究［1，2］提示，多种免疫活性细胞产生的致炎因子，可能是造成肾脏病理损害及炎症反应的直接因素，其中IL18作为上游致炎因子其水平与病情的进展高度相关，有望成为治疗研究的新的靶分子，且IL18BP中和内源性IL18的作用已被证实［3］。本实验利用昆明鼠建立阿霉素微小病变型肾病综合征模型［4］，再应用mIL18BP对模型鼠进行干预，观察其疗效并进一步分析IL18等在疾病中的作用。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物  昆明种小鼠30只,体质量（20±2）g，雄性，4～6周龄。随机分为正常对照组、阿霉素肾病造模组（ADRMCN组）、白介素18结合蛋白治疗组（IL18BP治疗组）3组,每组10只，用苦味酸分别标记，分笼饲养，喂养环境及食物等其他条件均完全相同。

    1.2  造模方法  实验前先将小鼠分别放入代谢笼内饲养,禁食不禁饮,收取24 h尿蛋白，然后将ADRMCN组、IL18BP治疗组于试验开始后一次性尾静脉注射阿霉素（深圳万乐药业有限公司,批号: H44024359，规格:10 mg/瓶）7.5 mg/kg, 正常对照组尾静脉注射等量生理盐水。IL18BP治疗组于第5、7、12、21天腹腔注射mIL18BP 0.5mg/kg［5］，同时ADRMCN组腹腔注射等量的0.1 M PBS。并于第14、28、42天分别收取24 h尿液作蛋白定量（双缩脲法）。

    1.3  检测指标  6周后，将小鼠用4%水合氯醛麻醉，心内取血处死，4 000 r/min高速离心，取血清测定生化指标甘油三酯（TG）、总胆固醇(TC)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）；ELISA法检测IL18水平。

    1.4  统计分析  采用SPSS12.0统计软件包进行统计学分析，所有数据用x±s表示,组间比较采用t检验、ANOVA 检验及Pearson相关系数检验，P＜0.05有统计学意义。

    2  结果

    2.1  一般情况  实验过程中, ADRMCN组有2例死亡。除正常对照组外,其余两组均有不同程度的摄食减少、精神不振、尿量减少、身体浮肿、卷毛、脱毛、体毛光泽度欠佳、活动迟缓等现象,以ADRMCN组尤为明显。

    2.2  动态24 h尿蛋白定量(24 hUPE)的测定  见表1。表1  各组24 hUPE的测定表1结果提示，阿霉素注射后小鼠于第2周尿蛋白开始升高，明显高于正常对照组（P＜0.01）；第4周达高峰，并在整个研究期间维持高蛋白尿水平。经mIL18BP治疗后阿霉素肾病小鼠尿蛋白虽高于正常组（P＜0.01），但其研究期间24 h尿蛋白定量明显低于ADRMCN组（P＜0.01）。

    2.3  血清生化指标的测定  见表2。表2  各组血清生化指标比较表2结果提示，与ADRMCN组比较，正常对照组TP、ALB、 TG、TC水平都有显著性差异 (P＜0.01)； IL18BP治疗组血清TP、ALB水平有所回升(P＜0.01),TG、TC水平有所降低(P＜0.01)；但BUN、Scr指标各组间无明显差异(P＞0.05)。

    2.4  血清中相关细胞因子IL18的测定  见表3。表3  血清细胞因子IL18水平测定 注： 与ADRMCN组比较,*P＜0.01

    表3结果提示，与ADRMCN组相比，正常对照组和IL18BP治疗组血清IL18水平较低，且均有显著性差异（P＜0.01）。

    2.4  6周末尿蛋白与血清IL18水平的相关性  血清IL18与24 h尿蛋白定量呈显著正相关（r=0.708，P＜0.01）。

    3  讨论

    3.1  ADRMCN小鼠模型的建立  ADR模型是目前公认的较为成熟的人类MCN动物模型,本研究首次选用了昆明种小鼠，在阿霉素造模后2周，小鼠24 hUPE逐渐升高,第4周达到高峰；同时表现为低蛋白血症和高胆固醇血症。6周后造模组肾脏病理切片光镜下出现肾小球轻度充血和/或肾小球内系膜细胞轻度增生，毛细血管腔狭窄甚或闭塞；透射电镜下出现毛细血管腔内有红血球瘀积,内皮细胞肿胀，线粒体肿胀，基质坏死, 部分嵴排列紊乱、消失, 部分膜破损，数目减少，绒毛稀疏，肾小球脏层上皮细胞轻度肿胀，足细胞的足突融合成片甚至消失，基底膜增厚等病理改变。结果从体征、尿蛋白、生化指标及光镜、电镜下的病理改变都接近人的微小病变型肾病综合征，证明ADRMCN模型成功建立。ADRMCN组有两只小鼠死亡，可能是由于阿霉素的毒性作用引起了肾组织的急性损伤所致。

    3.2  IL18BP对阿霉素肾病模型的干预作用  有研究表明［6］，IL18BP在体外能消除IL18诱导的IFNγ和IL8的产生以及对NFκB的激活［7］,还能降低细菌引起的IFNγ的产生，将IL18BP注射给脂多糖处理的小鼠,能降低其血循环中IFNγ和IL8的水平。据报道［8～10］，IL18单克隆抗体、可溶性IL18受体及IL18BP可应用于某些免疫相关疾病如RA的治疗。本实验从细胞因子的角度审视肾病综合征的治疗，利用IL18BP结合内源性IL18，选择恰当时机及合适剂量进行干预，从而从上游阻断局部致病因子，重建了内源性的免疫平衡。研究中，经mIL18BP干预后阿霉素肾病小鼠虽于第2周尿蛋白也开始升高，但同时从第2周开始及其后研究期间24 h尿蛋白定量明显低于ADRMCN组；血生化指标检测结果也提示IL18BP治疗组与ADRMCN组比较TP、ALB水平有所回升,TC、TG有所降低；IL18BP治疗组血清IL18水平与ADRMCN组相比也明显降低，且IL18水平与24 h尿蛋白定量之间呈显著正相关，与相关报道［11，12］一致。以上结果都表明IL18与MCN的发病之间有着某种必然的联系，IL18BP通过靶向性适度地抑制过度表达的IL18，从而明显改善病情，控制了炎症的进一步发生。与内源性IL18的结合间接的减轻了致炎因子在肾内的聚集，从而减少蛋白质的渗漏，减轻了对肾脏的损伤作用，进而缓解ADR肾病；另一方面IL18BP与肾内IL18受体竞争性结合IL18也减少了免疫复合物在肾内的沉积，从而减轻了后者对肾小球系膜细胞的刺激，达到了减轻肾脏病理损伤，改善肾脏功能的良好治疗作用，且研究过程中并无明显副作用出现。

    总之，本研究说明细胞因子尤其是IL18的参与在人类肾病综合征的发病病因和病理病程进展方面有着极其重要的作用。IL18BP作为调节IL18的特异性细胞因子有着针对性强、靶位点明确的特点，可为临床治疗肾病综合征提供一种新的思路和方法。只是目前人IL18BP造价甚高，提取较难，还未大量生产，仅仅用于科研，给IL18BP的临床应用带来了一定的困难，但相信随着研究的进一步深入，这个问题会逐渐得到解决。
　　

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作者单位：1 滨州医学院基础学院 滨州市 256603；2滨州医学院中西医结合学院；3　高青县人民医院外科