前列腺素E1对兔急性心肌梗死再灌注后P选择素及无复流的影响

【摘要】  目的 探讨兔急性心肌梗死再灌注后无复流现象与炎症的关系，评价前列地尔（前列腺素E1）对炎症的影响及对无复流的作用。方法 建立大白兔心肌缺血再灌注损伤动物模型，随机分为假手术组、对照组和前列地尔治疗组，免疫组织化学法观察心肌P选择素（Ps）的变化，最后计算心肌梗死面积及无复流面积。结果 Ps免疫组化显示，对照组及治疗组中，Ps在复流区及无复流区血管内皮细胞有强表达，明显强于正常区及假手术组（P均＜0.01）；无复流区表达强于复流区（P＜0.01）。前列地尔治疗组与对照组比较，Ps在复流区及无复流区表达均明显减弱（P ＜0.01）。病理染色分析示，前列地尔治疗组与对照组比较：结扎区面积差异无统计学意义（P＞0.05）；无复流面积和坏死心肌面积均较对照组显著降低(P均＜0.01)。结论 前列地尔（PGE1）能通过抑制炎症反应起到保护心肌，减少心肌梗死面积，减少无复流面积的作用。

【关键词】  无复流； 炎症反应； P选择素； 前列地尔

Effect of prostaglandin E1（PGE1）on Pselectin and noreflow in a rabbit model of acute

    myocardial infarction and reperfusion

    ZENG Jing  SUN Jingwu

    Department of Cardiovascular Medicine,Affiliated Hospital of Binzhou Medical University,Binzhou  256603

    【Abstract】  Objective  To investigate relationship between noreflow phenomenon and inflammation in a rabbit model of acute myocardial infarction and reperfusion.To evaluate effects of prostaglandin E1 on inflammation and noreflow phenomenon in a rabbit model of acute myocardial infarction and reperfusion.Methods   Erect animal model of myocardium ischemiareperfusion. To observe myocardial Pselectin (Ps) by immunohistochemical (IHC) method.The area of noreflow was evaluated with pathological means. Necrosis area was measured with triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining.Results  In the control and treatment groups, it was showed by IHC that Pselectin powerfully expressed in vascular endothelial cell of reflow and noreflow myocardium, and more powerfully than normal myocardium and shamoperated groups（all P＜0.01）, and its expression in noreflow myocardium was more powerful than that in reflow myocardium（P＜0.01）.In treatment groups, its expression in reflow and noreflow myocardium respectively attenuated significantly than that in the control group（P＜0.01）.the coronary ligation area in treated group compared with the control group, there was no significant difference（P＞0.05）.The area of noreflow of treatment group decreased significantly (P＜0.01).the necrosis area of treatment group also decreased significantly(P＜0.01).Conclusion  Preconditioning  with prostaglandin E1 may protect myocardial tissue and decrease necrosis area and the area of noreflow by controlling inflammation.

    【Key words】  noreflow,inflammation,Pselectin,prostaglandin E1

    急性心肌梗死(AMI)发病凶险，病死率高，治疗的关键是尽早给予冠状动脉(冠脉) 血管重建,包括药物溶栓、经皮冠状动脉腔内成形术(PTCA) 、支架及冠状动脉搭桥等,使梗死相关动脉再通,恢复心肌灌注。然而在临床实践中,某些心外膜血管在再灌注治疗期间已解除机械性梗阻,但相应心肌组织并没有完全有效地恢复血流灌注,即无复流（NR）现象。Abbo等［1］指出无复流作为一种并发症,使住院死亡和危险区心肌梗死MI发生率增加5～10倍。无复流本身虽不是MI的最初原因,但无复流是继续缺血、梗死延展、心室重构、心功能恢复障碍及MI急性期高死亡率的预测指标,也是严重心肌和微血管损伤的标记。无复流是评估现代再灌注治疗成功与否的主要指标之一,因此成为近年来研究的焦点。虽然人们已经很清楚微血管水平的异常导致了NR现象,但确切的机制不明;许多因素可能促成其发生。可能的机制有：内皮的缺血性损伤和心肌细胞水肿、白细胞的作用、血小板的作用、动脉粥样硬化碎片的微栓塞。近年来研究表明炎症反应在NR发生及发展过程中有非常重要的作用。

    前列腺素E1（PGE1）是内源性物质, PGE是多不饱和脂肪酸二γ亚麻油脂酸(DGLA)的氧化产物。PGE1是一种有效的血管扩张剂, 具有稳定生物膜、抑制中性粒细胞(PMNs) 、保护血管内皮细胞、抑制血小板的粘附聚集、降低血液粘滞度、改善血液流变学特性等作用。最近研究表明PGE1有较强的炎症抑制作用。我们复制了兔心肌缺血再灌注无复流模型，进一步探讨了无复流的炎症机制及PGE1对无复流的防治作用及其可能机制。

    1  材料与方法

    1.1  材料  实验动物：健康新西兰大白兔24只，雄性，体重（2.3±0.2）kg。实验试剂: 前列地尔（PGE1，100 μg/支，国药准字H41024187，南阳普康药业有限公司提供）；P选择素(Ps)一抗（上海麦莎生物技术公司）；生物素化山羊抗兔IgG抗体（武汉博士德生物技术公司）；DAB免疫组化显色试剂盒(AR1022)（武汉博士德生物技术公司）。

    1.2  方法

    1.2.1  动物模型的制备及分组：健康雄性新西兰大白兔24只，重约2.5 kg，由山东农业科学院实验动物中心提供。实验分组：随机分为PGE1治疗组（8只）、对照组（8只）、假手术组（8只）。动物模型制备：①PGE1治疗组（8只）：大白兔仰卧位固定于手术台上，剪毛，碘伏消毒，3%戊巴比妥钠30 mg·kg-1经兔耳缘静脉注射麻醉，术前常规作心电图。沿胸骨左缘切开第3、4肋软骨，打开胸腔，剪开心包，结扎前由耳缘静脉滴注5%葡萄糖250 ml+前列地尔（10 μg·kg-1），在冠状动脉左回旋支（LCX）远端1/3～1/2处结扎，肉眼观察到结扎点的远端心前壁变紫、心电图ST段上抬证实为心肌梗死。结扎4 h后松开结扎线进行再灌注，再灌注以心前壁颜色好转，心电图30 min内ST段下降50%为再通指标。②模型对照组（8只）：与PGE1治疗组相同方法制模，结扎前静脉滴注5%葡萄糖250 ml，结扎4 h后松开结扎线。③假手术组：以同样方法消毒、麻醉、开胸后，剪开心包，在左冠状动脉回旋支挂线但不结扎。

    1.2.2  HE染色及免疫组化：取各区域心肌标本用40 g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋，HE 染色，常规制片，光镜观察各组细胞水平的变化情况。免疫组化法测定心肌各区域心肌组织中的Ps表达水平。

    1.2.3  病理形态学观察：再灌注后120 min，按1ml·kg-1从左心房注入60 g/L的硫黄素（thioflavinS，生理盐水溶解，然后1500 r/min离心5 min），结扎区中无复流区不着色，其余心肌区着色；再于原位重新结扎冠状动脉左回旋支（LCX），从左心房再注入Evan's蓝，使结扎区外着蓝色，结扎区不着蓝色。立即取出心脏，剪除左右心耳、右心室及残余大血管，于冰生理盐水中荡洗去除残余血液，并沿心脏长轴分为5～6心肌短轴切片，结果非结扎区心肌呈蓝色，结扎区在紫外线（波长365 nm）下无复流区不显色，复流区显色。计算出左心室室壁心肌面积、结扎区（无蓝色）心肌面积及无复流区（紫外线下不显色）面积；同样依结扎区心肌面积/左心室室壁心肌面积计算出结扎区心肌范围（ligation area，LA），依无复流区面积/结扎区心肌面积计算出心肌无复流心肌范围（area of noreflow，ANR）。最后将整个心肌切片放入10 g/L的四氮唑红（triphenyltetrazolium chloride，TTC）溶液（pH7.4）中，37℃孵箱中孵化15 min，梗死心肌不着色，非梗死部位心肌呈砖红色，立即对切片进行拍照，计算出梗死心肌面积，以梗死心肌面积与结扎区心肌面积之比作为坏死心肌范围（necrosis area，NA）。

    1.3  统计学处理  采用SPSS13.0进行统计学处理，实验数据用 表示，多个样本均数的比较用方差分析，两样本均数的比较用t检验，以P＜0.05表示有统计学差异。

    2  结果

    2.1  前列地尔对兔AMI再灌注后心肌无复流范围和梗死范围的影响（见表1）  前列地尔治疗组与对照组相比，LA差异无统计学意义（P＞0.05），ANR显著降低（P＜0.01），NA亦显著降低（P＜0.01）。表1  各组心肌范围的比较

　　2.2  心肌Ps免疫组化结果（见表2，图1～4）  对照组及治疗组中，Ps在复流区及无复流区血管内皮细胞有强表达，明显强于正常区及假手术组（P均＜0.01）；无复流区表达强于复流区（P＜0.01）。前列地尔治疗组与对照组比较，Ps在复流区及无复流区表达均明显减弱（P＜0.01）。表2  各组在各区域心肌组织Ps的IOD值分析

    3  讨论

    近30余年的临床与基础研究证明，炎症在缺血性心脏病的发生与发展中起着关键作用［2］。研究发现，在心肌缺血再灌注过程中，炎症损伤贯穿于心肌细胞损伤的全过程，且能够渗透到其他损伤因素中发挥作用，是十分活跃的中介因子。Topol等［3］研究发现，炎性刺激可使纤维帽破裂，使内膜下基质直接暴露，稳定的动脉粥样硬化斑块变成不稳定斑块，导致脂质、基质、内皮细胞或血小板栓子在血管的远端发生栓塞，从而加重无复流。

    Ps是黏附分子选择素家族成员之一，又称颗粒膜蛋白GMP140或CD62p，是一种分子量为140　kD的膜糖蛋白，在人体大多数组织如心、肝、肺、结肠、肾的血管内皮及血小板上表达，但含量低，主要分布于静止血小板的α颗粒和内皮细胞的weibelpalade体中。当受到缺氧、自由基、凝血酶、腺苷二磷酸（ADP）等的刺激后，发生脱颗粒反应，颗粒膜与细胞膜融合，使Ps表达到细胞膜上，与中性粒细胞、单核细胞上的抗原结合，介导白细胞在内皮上黏附、滚动、聚集、活化并释放炎性递质，参与炎症过程［4,5］。本实验发现，Ps在对照组复流区及无复流区血管内皮细胞有强表达，明显强于正常区及假手术组(P＜0.01)，与李京波等［6］报道一致，提示炎症反应可能是心肌缺血再灌注后无复流发生的机制之一。

    PGE1是内源性活性物质,具有扩张血管、抑制白细胞和血小板聚集、保护血管内皮细胞、改善红细胞变形性及改善微循环与组织灌注的作用［7］，此外PGE1还有炎症抑制作用。赵耐久等［8］研究表明前列地尔有明显的抑制动脉粥样硬化形成机制中炎症反应的作用。孙勇等［9］研究表明PGE1在急性冠脉综合征患者早期使用可控制炎症活动。本实验中前列地尔治疗组与对照组相比，无复流心肌面积和坏死心肌面积明显减少(P均＜0.01)，提示前列地尔对心肌再灌注后无复流有较好的防治作用；前列地尔治疗组与对照组相比，同一区域Ps的表达明显降低(P＜0.01)，提示前列地尔可能通过抑制炎症反应起到防治无复流的作用。

    综上所述，心肌缺血再灌注后炎症反应与无复流现象的发生发展有密切关系，可能是无复流现象发生的重要机制。前列地尔具有抗炎作用，对心肌再灌注后无复流有较好的防治作用，减少梗死面积。本实验为前列地尔对于急性心肌梗死冠状动脉再通后无复流的防治的临床应用提供了理论依据，为临床防治无复流提供了新的治疗思路。

【参考文献】
  1］ Abbo KM, Dooris M, Glazier S ,et al.Features and outcome of noreflow after percutaneous coronary intervention［Ｊ］. Am J Cardiol , 1995 ,75 :778782.

［2］ Uyarel H, Uzunlar B, Unal Dayi S,et al.Effect of tirofiban therapy on ST segment resolution and clinical outcomes in patients with ST segment elevated acute myocardial infarction undergoing primary angioplasty［J］.Cardiology, 2006,105(3):168175.

［3］ Reffelmann T , Kloner RA. The noreflow phenomenon :A basic mechanism of myocardial ischemia and reperfusion［J］.Basic Res Cardiol,2006,101:3592372.

［4］ Lefer AM, Weyrich AS, Buerke M．Role of selectins, a new family of adhesion molecules, in ischemiareperfusion injury［J］.Cardiovasc Res, 1994, 28: 289294.

［5］ Ma XI, Weyrich AS, Lefer DJ,et al. Monoclonal antibody to Lselectin attenuates neutrophil accumulation and protects ischemic reperfused cat myocardium［J］.Circulation, 1993, 88: 649658.

［6］ 李京波,马士新,魏盟,等.急性心肌梗死患者血浆可溶性Ps等因子的动态变化及早期再灌注治疗对其影响［J］.临床心血管杂志, 2005, 21(6): 322324.

［7］ Marc DP，Shaf K.Lung preservation［Ｊ］.Current opinion organ transplant,2001，6:223.

［8］ 赵耐久，孙秀斓.前列地尔对不稳定型心绞痛患者炎症反应指标的影响［J］.中国基层医药，2007，14(3)：400401.

［9］ 孙勇，王建安.前列腺素E1对急性冠脉综合征早期部分炎症因子的影响［J］.中华急诊医学杂志，2005，14(5)：405407.

作者单位：滨州医学院附属医院心内科 滨州市 256603