黄芪对梗阻性黄疸幼鼠肝脏超微结构及IL10 mRNA表达的影响

【摘要】  目的 建立幼鼠梗阻性黄疸模型，对模型鼠应用黄芪干预，观察胆道梗阻后肝脏超微结构和IL10 mRNA表达的改变，探讨黄芪对上述指标的影响。方法 将40只Wistar幼鼠随机分为正常对照组、假手术组、梗阻性黄疸（OJ）组和OJ+黄芪（A）组，每组10只。OJ组鼠于近肝门处游离并结扎胆总管，假手术组仅做游离不结扎胆总管。OJ+A组术后1d开始腹腔注射黄芪注射液（250 mg/100 g体重）共7 d，其余组相同时间腹腔注射生理盐水0.5 ml。检测实验鼠肝脏超微结构改变；应用RTPCR技术检测肝组织IL10 mRNA表达，对所得数据进行统计学处理。结果 (1)电镜下正常对照和假手术组肝细胞结构完整，细胞器分布均，线粒体正常。Disse间隙内可见枯否细胞，OJ组肝细胞内线粒体明显肿胀、减少、外膜不清、嵴消失，粗面内质网数量减少，滑面内质网增多、核糖体脱颗粒。肝细胞内质网扩张，细胞核边聚，毛细胆管扩张。OJ+A组肝细胞的超微结构变化较轻。(2)IL10 mRNA基因表达OJ组显著高于对照组及OJ+A组，均P＜0.05。结论 梗阻性黄疸幼鼠模型肝脏超微结构显著改变;幼鼠胆管结扎8 d，肝组织的IL10 mRNA表达增强;应用黄芪的梗阻性黄疸幼鼠肝细胞超微结构改变较轻,减轻肝脏IL10 mRNA的表达，从而对梗阻性黄疸诱发的肝脏损害有保护作用。以上结果证实黄芪可较好的改善梗阻性黄疸机体的营养状况，对受损的肝脏起保护作用。

【关键词】  梗阻性黄疸；黄芪；基因表达；IL10 mRNA

Effects of astragalus on liver ultrastructure change and IL10 mRNA expression in growing rats with obstructive jaundice

    FU Tingliang1,2  ZHANG Wentong1  GAO Yong2  et al

    1 Department of Pediatric Surgery,Qilu Hospital of Shandong University,Jinan  250012;2 Binzhou Medical University

    【Abstract】  Objective  To evaluate the effects of astragalus on liver ultrastructure change and IL10 mRNA expression in immature rats with obstructive jaundice(OJ).Methods  Forty immature male Wistar rats were randomly divided into control,sham operation,OJ,and OJ+A groups. Wistar rats in OJ and OJ+A groups were subjected to common bile duct ligation(CBDL),while sham group had the bile duct mobilized but not tied. The control,sham,OJ groups were given 0.5 ml of normal saline by intraperitoneal injection daily.In OJ+A groups,250 mg/kg of astragalus injection was applied intraperitoneally daily from day 1 to 7 of the study.All animals were sacrificed on postoperative day 8. Liver tissues were collected and observed by transmitting electron microscopy.IL10 mRNA was extracted from liver and measured by reverse transcription polymerase chain reaction(RTPCR).Data were analyzed using chisquare test and student's test,P＜0.05 was considered statistically significant.Results  ①Electron microscopy revealed a normal hepatocytes'ultrastructure in control and sham operation groups,but in OJ group hepatocytes showed severe mitochondrial swelling.There were slight ultrastructural alterations in OJ+A group.②The IL10 mRNA over expression in OJ group were seen compared with control,sham,OJ+A groups.Conclusion  ①In growing rat model of experimental obstructive jaundice, hepatic morphology and liver biochemical tests altered significantly.②Over expression of hepatic tissue IL10 mRNA was  demonstrated in OJ group.③The administration of astragalus can ameliorate liver ultrastructural change in obstructive jaundice.Astragalus injection can diminish expression of IL10 mRNA in hepatic tissue,thus administration of astragalus may be effective in preventing hepatic fibrosis in obstructive jaundice.Further studies are required to delineate the mechanisms of protective effects of  astragalus.

    【Key words】   obstructive jaundice,astragalus,liver utrastructural damage,gene expression, interleukin10 mRNA

    梗阻性黄疸(OJ)易发生肝脏纤维化，枯否细胞(Kupffer cells, KC)在发挥防御作用的同时, 可释放多种化学介质介导肝脏损伤, 如肝纤维化(hepatic fibrosis, HF)，KC分泌的细胞因子参与HF的发生与发展［1］。因此, 研究KC在HF发生与发展中的作用和机制以及与KC相关的抗纤维化治疗策略及方法, 对防治梗阻性黄疸所致的肝纤维化, 改善肝功能和患者的生存质量具有重要意义。黄芪主要含三萜皂苷、黄酮类化合物以及黄芪多糖，是一种扶正补气的中药。黄芪总苷(Astragalosides，AST)是从黄芪中提取的有效成分，研究发现AST具有抗炎、抗氧化、免疫调节、抗肝损伤和抗肝纤维化等作用［2］。白细胞介素（IL）10是由Th2细胞亚群分泌的具有多种生物学活性、参与免疫调节的抑制性细胞因子，可减轻肝脏炎症, 抑制肝纤维化的发展［3］。我们建立了幼鼠梗阻性黄疸模型，应用黄芪对模型鼠进行干预，在探讨幼鼠胆道梗阻后黄芪对OJ鼠肝脏功能、形态学、TGFβ1mRNA表达的影响［4］的基础上，进一步观察了肝脏超微结构和IL10 mRNA表达的改变。

    1  材料与方法

    1.1  研究对象  普通级雄性Wistar大鼠40只，21～25日龄，体重80～100 g,由山东大学动物实验中心提供,合格证号SCXK(鲁)20030004。由山东大学新药评价中心提供饲养环境和标准饲料。室内温度保持在18～25℃的条件下适应性喂养1周，随机数字表法将实验鼠随机分为四组：正常对照组、假手术组、OJ组、OJ+A组，每组10只。模型制作成功后将大鼠置于室温22～26 ℃、相对湿度40%～70%、安静、通风的环境中分笼喂养。

    1.2  模型制作与喂养方法，给药途径和用量  大鼠术前禁食12 h，禁水4 h。氯胺酮(20 mg/kg)腹腔注射麻醉，取上腹正中切口，显露肝十二指肠韧带，于近肝门处游离并结扎胆总管。假手术组不结扎胆总管。OJ组术后3 d采静脉血检查血总胆红素和直接胆红素，测得值高出正常5倍为模型制作成功的标准。OJ+A组术后1 d开始腹腔注射黄芪注射液（250 mg/100 g体重）共7 d，其余组相同时间腹腔注射生理盐水0.5 ml。

    1.3  样本采集、预处理与观察方法

    1.3.1  肝功能及肝脏病理形态学观察:见参考文献［3］。

    1.3.2  透射电镜观察：每组取2只实验鼠,用双面刀片取1 mm×1 mm×1 mm肝左叶1块，迅速置于预冷的2.5%戊二醛溶液中前固定，4℃保存，备透射电镜观察。切取组织时，应避免挤压。将标本以0.1 mol/L磷酸缓冲液(PBS)冲洗3次，乙醇梯度脱水，环氧树脂(Epon)812包埋。超薄切片机(ReichertJung)切片，切片厚60 nm，醋酸双氧铀柠檬酸铅双重染色，透射电镜(日本电子，JEOL，JEM1200EX）观察，每个标本观察2个切片。透射电镜下观察肝细胞膜、线粒体、粗面内质网、滑面内质网；Disse间隙、肝枯否细胞、汇管区胶原纤维；成纤维细胞、胶原沉积以及肝细胞的凋亡情况。肝细胞凋亡表现为细胞皱缩，核染色质浓缩，核裂解成碎片，细胞器的形态基本正常。凋亡细胞可见核边聚或碎裂，染色变深，质膜皱折、卷曲及凋亡小体。

    1.3.3  肝脏组织IL10 mRNA表达的检测:应用逆转录多聚酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RTPCR)技术检测。每组5只实验鼠，取肝左叶部分肝组织迅速置于液氮中，然后转入-80℃冰箱中保存。UNIQ10柱式Trizol总RNA提取试剂盒购自上海生工生物工程公司。细胞因子引物、内对照(βactin)、标准标记物（Marker）由上海生工生物工程公司公司合成。各目标基因引物序列及产物片段长度(bp)如下:IL10(351bp)  5'TGC CAA GCC TTG TCA GAA ATG ATC AAG3',5'GTA TCC AGA GGG TCT TCA GCT TCT CTC3'；βactin(548bp)  5'AGA AGA GCT ATG TGC CTG ACG3'，5'CTT CTG CAT CCT GTC AGC GAT GC3'。

    严格按照RTPCR的方法进行操作，PCR产物行琼脂糖凝胶电泳，溴乙啶染色，紫外光下观察并摄片，电泳鉴定。将凝胶电泳图像输入美国Kodak凝胶分析系统，应用1 D Image Analysis Software进行表达强度分析，按下公式计算相对系数（基因表达值）。基因表达值=细胞因子表达强度/ β肌动蛋白（ βactin）表达强度。

    1.4  统计学处理  用统计学软件SPSS13.0进行统计分析，计量资料用x±s表示，多组间均数两两比较用单因素方差分析，多样本两两比较(三个手术组与对照组)用Dunnett法。

    2  结果

    2.1  实验动物存活情况  OJ组实验鼠分别于术后1 d,3 d,7 d各死亡1只，术后8 d死亡1只，为胆道穿孔所致腹腔感染。OJ+A组术后3d死亡1只。

    2.2  电镜下肝脏超微结构改变  正常对照和假手术组肝细胞结构完整，细胞器分布均匀，细胞内含粗面内质网和小而圆的线粒体，肝细胞的绒毛伸入到狄氏间隙或毛细胆管；Disse间隙内可见枯否细胞，呈扁圆状，异染色质在核膜区域聚集；除汇管区以外未见明显胶原原纤维。OJ组肝细胞内线粒体明显肿胀、减少、外膜不清、嵴消失，粗面内质网数量减少，滑面内质网增多、核糖体脱颗粒；成纤维细胞形成，其周围有胶原沉积，肝细胞内质网扩张，细胞核边聚，毛细胆管扩张，胞浆呈空泡状，可见新生小毛细胆管。对照组枯否细胞形态不规则, 其细胞外衣较厚, 表面伸出许多板状或丝状伪足, 并有许多微绒毛或皱襞, KC胞核较大, 胞质内溶酶体发达。OJ组枯否氏细胞肿胀明显，汇管区易见胶原原纤维、纤维母细胞和炎细胞浸润。OJ+A组汇管区可见枯否细胞肿胀轻、胶原原纤维较少。具体电镜下肝脏超微结构改变见图1～6。

    2.3  肝脏IL10 mRNA表达  正常对照组和假手术组肝脏IL10 mRNA表达较弱，OJ组表达明显增强。OJ+A组肝脏IL10 mRNA表达较弱。经方差分析各组均数间差别有统计学意义（F=12.35,P＜0.01)。进一步两两比较，假手术组和OJ+A组与对照组均没有差别，ＯＪ组ＯＤ值高于对照组，见表１。表1  各组幼年大鼠肝脏ＩＬ１０ mRNA表达（OD值）

    3 讨论

    3.1  枯否细胞（KC）定居于肝窦腔内，其数量占单核巨噬细胞系统的80%～90%，KC胞浆丰富而且形成很多胞突呈星形，胞突伸入内皮细胞小孔内，有利于KC吞噬血流中细菌和一些颗粒性物质。正常情况下，KC会受到来自胃肠道的持续不断的少量内毒素的刺激，呈现低度激活状态。来自肠道的内毒素大部分被KC摄取，经修饰后释放出来的内毒素更易进入肝实质细胞，使机体产生免疫耐受，避免了内毒素的直接和间接损伤。大鼠胆总管结扎后KC功能受损，吞噬功能受到抑制，对入血的内毒素清除功能减弱。梗阻性黄疸时肝纤维化致肝内短路和门脉高压侧支循环形成的肝外短路，使得血流不能与KC充分接触，内毒素不能被KC吞噬而直接进入体循环，导致内毒素血症。研究发现用内毒素灌注离体的大鼠肝脏能导致Disse腔扩张，KC肿胀［5］。本研究观察到OJ组大鼠肝脏Disse腔扩张，KC肿胀现象，可能与内毒素损害有关。

    3.2  细胞因子是在免疫应答过程中由免疫活性细胞及炎性细胞产生的一系列多肽因子。在生理状态下，这些细胞因子调节免疫细胞的活性，增强机体的免疫力，病理状态下过量产生导致毒性作用［6］。肝纤维化（hepatic fibrosis，HF）是指肝脏内细胞外基质的合成大于降解，导致纤维结缔组织过度沉积。HF是多种慢性肝病病情发展的共同病理基础，是发展至肝硬化的必经阶段。肝纤维化发生、发展与体内多种细胞因子合成与功能失调有关。通过对HF发生机制的研究发现,肝星状细胞（HSC）的激活、表型改变并分泌大量的细胞外基质是HF发生的中心环节。细胞因子在肝星状细胞的活化、表型改变并分泌大量的细胞外基质中扮演重要角色［7，8］。白细胞介素（IL）家族中既有促进又有抑制肝纤维化形成的因子，IL4、IL10抑制HSC的激活，IL1，IL6可促进肝HSC细胞增殖，刺激HSC合成胶原蛋白。

    IL10是由Th2细胞亚群分泌的具有多种生物学活性、参与免疫调节的抑制性细胞因子，作用于单核巨噬细胞、Th1细胞、NK细胞、中性粒细胞、上皮细胞等多种细胞。通过抑制单核细胞分泌多种细胞因子来抑制抗原呈递辅助细胞的功能，从而抑制细胞的免疫功能［8］。当机体处于应激状态时，组织中的Th2细胞被激活，分泌免疫抑制因子IL10，对大鼠腹腔感染和早期脓毒症时的炎症有一定的抑制作用。IL10通过抑制核转录因子κB的活性，减少TNFα、IL6、IL1等炎性因子的表达，从而发挥抗炎作用［8］。KC分泌的促炎因子主要有TNFα和IL1。IL1含量与肝纤维化严重程度呈正相关。KC分泌抑炎因子, 其中IL10是抑制间质炎症反应的重要因子。IL10可通过抑制炎症反应、促进Ⅰ型和Ⅲ型胶原的降解而发挥逆转HF作用［9］。在HF过程中, KC分泌的促炎因子和抑炎因子是不平衡的,促炎因子的分泌量远远多于抑炎因子。HF是各种慢性肝病发展为肝硬化的必经病理过程,以细胞外基质(extracellular matrix, ECM)在肝脏窦周间隙的过量沉积为特征［10］。ECM主要由肝脏星状细胞(hepatic stelate cell, HSC)产生合成, ECM的降解则主要由基质金属蛋白酶以及金属蛋白酶组织抑制因子参与调节［8］。本研究采用RTPCR技术检测了各实验组肝组织的IL10 mRNA表达。正常对照组和假手术组肝脏IL10 mRNA表达较弱，OJ组表达明显增强，差异有显著性。OJ+A组肝脏IL10 mRNA表达较弱，与对照组和假手术组比较，差异无显著性。

    3.3  黄芪对梗阻性黄疸肝功能损害和形态学改变的保护作用  目前肝脏损害防治研究的主要方向是细胞因子、基因干预、信号转导调节、中医中药等，其中中药抗肝纤维化研究是我国的特色和优势。通过中药制剂作用于肝纤维化的发病环节，达到抑制肝纤维化的目的。HSC在肝纤维化发病中起关键作用，当肝脏受到致病因子的攻击，HSC被激活而大量增生，细胞内脂滴减少，内质网增多，转变成肌样成纤维细胞(myofibroblast，MFB)，最后成为成纤维细胞，合成过量的ECM沉积于肝脏。因此，抑制HSC的活化和增生对肝纤维化防治具有重要意义［11，12］。

    黄芪(Astragalus root,Astragalus membranaceus)的主要活性成分是黄芪多糖类、总黄酮、总皂甙等［2］,现代药理研究证明黄芪能增强机体免疫功能，对血液系统、心血管系统、泌尿系统、内分泌系统及中枢神经系统有影响，且具抗衰老作用。黄芪中含有硒，能激活DNA修补酶，刺激抗体产生，捕获有害自由基。中药制品黄芪注射液在临床上应用广泛，并取得显著疗效。黄芪中富含的微量元素硒能激活谷胱甘肽过氧化物酶而发挥抗氧化作用；激活解毒酶系，保护细胞膜，从而达到保护肝脏的作用。黄芪还可增加肝脏粗面内质网和细胞mRNA含量，抑制核糖核酸酶活性，促进蛋白质合成［3］。杨雁等［13］通过体内和体外实验发现黄芪总提取物对肝细胞损伤和凋亡均有保护作用，黄芪抗肝损伤作用可能与其抗凋亡和抗氧化作用有关。本研究观察到应用黄芪的梗阻性黄疸幼鼠肝细胞的超微结构改变较轻，表现为线粒体较发达，膜结构清晰，粗面内质网脱颗粒不明显。

    综上所述，梗阻性黄疸可诱发肝纤维化，严重影响患者的预后和生存质量。有关肝纤维化的机制和药物干预一直是研究的热点。中药在肝纤维化的防治方面有独特的优势，黄芪在实验研究和临床应用方面已有报道，有关黄芪减轻肝脏纤维化的机制有待于进一步研究。

    （致谢：山东大学齐鲁医院冯进波教授给予技术支持，特此感谢。）

【参考文献】
  ［1］ 赵闯,戴朝六.枯否细胞在肝纤维化中的作用［J］.世界华人消化志,2008,16 (26):29592963.

［2］ 陈健,房志仲.黄芪注射液的药理作用及临床应用［J］.天津医科大学学报,2005,11(1):153157.

［3］ 杨悦杰,黄 芬,胡 静,等.IL10对TGFβ1诱导的大鼠肝星状细胞CTGF表达的影响［J］.世界华人消化杂志,2008,16(19):21542157.

［4］ 傅廷亮,张兰,徐传臻,等.黄芪对梗阻性黄疸幼鼠肝损伤和TGFβ1表达的影响［J］.国际中医中药杂志,2008,30(4):243244,272.

［5］ Tomita K,Tamiya G,Ando S,et al.Tumour necrosis factor alpha signalling through activation of Kupffer cells plays an essential role in liver fibrosis of nonalcoholic steatohepatitis in mice［J］.Gut 2006; 55: 415424.

［6］ Lee HS, Miau LH, Chen CH,et al.Differential role of p38 in IL1 alpha induction of MMP9 and MMP13 in an established liver myofibroblast cell line［J］.J Biomed Sci,2003,10:757765.

［7］ Rockey DC,Maher JJ,Jarnagin WR,et al.Inhibition of rat hepatic lipocyte activation in culture by interferon-gamma［J］.Hepatology , 1992,16:776784.

［8］ Huang YH,Shi MN,Zheng WD,et al.Therapeutic effect of interleukin10 on CCl4induced hepatic fibrosis in rats［Ｊ］.World J Gastroenterol,2006,12:13861391.

［9］ Hung KS,Lee TH,Chou WY,et al.Interleukin10 gene therapy reverses thioacetamideinduced liver fibrosis in mice［J］.Biochem Biophys Res Commun,2005,336:324331.

［10］ Ide M, Kuwamura M, Kotani T,et al.Effects of gadolinium chloride (GdCl3) on the appearance of macrophage populations and fibrogenesis in thioacetamideinduced rat hepatic lesions［J］.J Comp Pathol,2005,133:92102.

［11］ Kawada N,Otogawa K.Role of oxidative stress and Kupffer cells in hepatic fibrosis［J］.J Gastroenterol Hepatol,2007,22 (Suppl 1): S85S86.

［12］ Xidakis C,Ljumovic D,Manousou P,et al.Production of pro and antifibrotic agents by rat Kupffer cells; the effect of octreotide［J］.Dig Dis Sci,2005,50:935941.

［13］ 杨雁,陈敏珠.黄芪总提物对肝细胞凋亡的抑制作用［J］.中国药理学与毒理学杂志,2001,15(4):287292.

作者单位：滨州医学院科研启动基金(BY2007KYQD06) 1 山东大学齐鲁医院小儿外科 济南市 250012；2 滨州医学院