匹鲁卡品癫痫模型及戊四氮点燃模型新生鼠行为学和组织学的对比研究

【摘要】  目的 比较匹鲁卡品（毛果芸香碱）点燃新生鼠痫性发作模型及戊四氮点燃模型的行为学特征及组织学改变,为实验模型的选择奠定基础。方法 选择SD新生大鼠为研究对象,制作两种不同的新生鼠癫痫模型,观察新生鼠的行为学表现、不同时点Nissl染色等组织学改变。结果 两种模型的行为学特征有所不同，匹鲁卡品点燃模型中未见神经元丢失及苔藓出芽现象，戊四氮癫痫持续状态模型中无神经元丢失，但明显出现苔藓纤维出芽现象。结论 腹腔注射匹鲁卡品小鼠模型是一种理想的颞叶癫痫动物模型，苔藓纤维出芽可作为判断癫痫持续状态模型是否成功的形态学标准。

【关键词】  癫痫模型；新生鼠；匹鲁卡品；苔藓纤维出芽

Comparison study of behavioral and histological changes between pilocarpineinduced epilepsy model and

    pentylenetetrazole kindling model in the neonatal rat

    LIU  Hongfu1  LI  Xiao1  LIU Xiaoran2  et al

    1 College of Basic Sciences  ,Binzhou Medical University ,Binzhou  256603 ;2 College of Nursing ,Binzhou Medical University

    【Abstract】  Objective  Comparison study of behavioral and histological changes between pilocarpine induced epilepsy model and pentylenetetrazole kindling model in the neonatal rat，to lay the foundation of the experiment model selection.Methods  SD neonate rats were selected as the research object .Two different epilepsy models were made to observe the behavioral changes and Nissl staining changes at different time points.Results  Two different epilepsy models have their characteristic behavioral changes.No neuron loss and mossy fiber sprouting were found in pilocarpine kindling model. No neuron loss were found with mossy fiber sprouting  in pentylenetetrazole statural epilepsy model.Conclusion  Pilocarpine induced status epilepticus mouse model is an ideal temporal epilepsy model, and the mossy fiber sprouting is a typical morphological character for evaluating the SE model.

    【Key words】  epilepsy models,neonatal rat , pilocarpine，mossy fiber sprouting

    癫痫动物模型在癫痫的病因学、发病机制、药理学等研究中占重要地位。神经元丢失及苔藓纤维出芽是癫痫产生过程中较常见的组织病理学变化。匹鲁卡品（毛果芸香碱）致癫模型及戊四氮点燃模型均是临床常用的新生鼠癫痫动物模型,两种模型各有不同特点,采用不同的模型可能会有不同的试验结果。目前的试验研究大都选择单一致癫模型，缺少对两种模型癫痫发作过程的对比性研究，本研究分别制作两种癫痫模型，同步观察两种模型不同的行为学特征和组织学改变,并探讨神经元丢失及苔藓纤维出芽在癫痫发病中改变情况［1，2］。

    1  材料与方法

    1. 1  实验动物与试剂  实验动物为烟台绿叶制药公司动物中心提供, 生后1 d的SD大鼠60只，随机分为盐水对照组、匹鲁卡品组、戊四氮组,每组20只，分别标记并与母鼠同笼喂养。匹鲁卡品、东莨菪碱、戊四氮均为Sigma公司产品。

    1. 2  癫痫模型的制作  匹鲁卡品组：先予东莨菪碱1 mg/kg腹腔注射，以拮抗外周胆碱能反应，30 min后腹腔注射10%匹鲁卡品350 mg/kg，若注射匹鲁卡品后30 min无惊厥发作,再按每次10 mg/kg 追加匹鲁卡品。若惊厥发作持续30 min 仍未停止,则给予水合氯醛400 mg/kg 腹腔注射,及时中止发作［3］。戊四氮组:首次腹腔注射惊厥阈下剂量戊四氮40 mg/kg , 10 min后注射20 mg/kg , 以后每10分钟注射10    mg/kg,直至出现6、7级抽搐发作。急性期诱发发作后,每天早7点到晚8点逐只观察动物有无自发性发作及动物的死亡情况［1］。对照组:给予生理盐水腹腔注射。

    1. 3   Lado 幼鼠癫痫发作分级标准［4］  0 级: 无发作;1 级:机械性咀嚼;2 级:连续性点头;3 级:单侧前肢阵挛;3.5级:前肢交替阵挛;4 级:双侧前肢阵挛、后退;5 级:双侧前肢阵挛、后退、摔倒;6 级:狂奔嘶叫;7 级:强直发作。

    1. 4  病理学研究  将致痫并存活的各组新生大鼠分别于模型成功制作后1 d及45 d给予水合氯醛腹腔麻醉,灌流固定取脑,在海马部位做冠状连续冰冻切片,切片厚度20 μm，每隔1张取片，分别行Nissl染色。首先入二甲苯,然后依次入100 %、95 %、85％、70 %、50％的梯度酒精,蒸馏水浸洗,入1 %的甲苯胺蓝染色,梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

    1.5  苔藓纤维发芽检测  取已经切好的冰冻切片于黑暗处 Timm 染色液中孵育，取出切片后冲洗, 梯度酒精脱水 , 二甲苯透明,玻片覆盖。半定量评分, 评分标准按苔藓纤维发芽量表进行［5］。

    1.6  统计学处理  实验结果以 x±s表示,应用SPSS 11.5 软件进行统计学处理，P＜0.05 为差异有统计学意义。

    2  结果

    2. 1  不同模型癫痫行为学的特征  匹鲁卡品组，匹鲁卡品的剂量为370 ～ 390 mg/kg , 诱发出现发作的平均时间为(13.2 ±2.6) min ,动物呈现凝视、机械性咀嚼、连续性点头及肌阵挛 ,无全身强直阵挛发作 ,发作持续时间在5～20 min。随着注射次数的增加 ,诱导惊厥发作的潜伏期缩短 ,匹鲁卡品所需剂量渐小 ,而发作等级发作程度逐渐增强。停止注射 1周后，无再次诱发情况下未观察到 4级以上自发发作。戊四氮组首次应用戊四氮40 mg/kg后,均在1～2 min出现全身抖动,躯体游走性痉挛,臀部上翘等表现。重复注射,动物很快出现兴奋性极度增高,狂奔、嘶叫、角弓反张,随即出现全身强直,末梢皮肤发绀, 3～10 s后出现节律性肢体阵挛抽动,逐渐肌肉松弛,抽动减少至停止,整个过程持续5～60 min。部分新生鼠发作停止数分钟后又再次发作,如此反复数次。对照组无发作。

    2. 2  神经元细胞计数及细胞形态学观察比较   不同实验组在1 d及45 d分别进行Nissl染色,观察海马各区锥体细胞层及齿状回门区神经元细胞的丢失情况。研究显示,同一组不同时点相同区域神经元计数无差异,两个致癫模型组及对照组CA3 区、CA1 区及齿状回颗粒细胞层分别见大量致密的锥体细胞及颗粒细胞,门区有中等量神经元,排列整齐,形态完整,胞浆内尼氏小体丰富,神经元呈蓝色,而背底几乎无色。与对照组比较,戊四氮组与匹鲁卡品组海马及齿状回未见明显神经元形态学改变和神经元丢失。

    2. 3  齿状回内分子层苔藓纤维出芽比较   模型制备完成后,不同组齿状回内分子层苔藓纤维出芽的比较发现,两组均可见齿状回颗粒细胞的轴突（苔藓纤维)进入门区 , 形成一致密的纤维带紧邻 CA3 锥体细胞层走行 , 结束于透明层。根据苔藓纤维发芽评分标准, 戊四氮组 CA3 区 Timm 评分 （1.56 ±0.08）明显高于匹鲁卡品组评分（0.55±0.09）, 差异有高度统计学意义（P＜0.01）。

    3  讨论

    啮齿动物如同人类一样,不同年龄阶段的神经系统发育情况不同,在研究动物癫痫或惊厥发作模型时必须考虑年龄或日龄因素。有统计资料显示儿童时期惊厥的发生率较一般人群高5～10倍, 尤以1岁以内婴儿最高, 同时临床实践表明, 小儿惊厥的发生发展过程包括惊厥的行为特征、脑电图变化及惊厥预后等均与成人明显不同, 癫痫持续状态的发生率远远高于成人［6］。戊四氮癫痫持续状态模型及匹鲁卡品点燃模型是常用的新生鼠癫痫模型,两种模型有不同的特点。

    本研究同步观察了两种模型不同的行为学特征、癫痫模产生过程中神经元的丢失,及苔藓纤维出芽的动态变化。结果显示,匹鲁卡品组大鼠通过反复注射, 80%左右的大鼠能够成功点燃，出现3次以上6或7级发作,但20%大鼠出现耐受现象,未出现6或7级发作，停止注射 1周后，无再次诱发情况下未观察到4级以上自发发作。戊四氮组首次应用阈下剂量注射,大鼠即迅速出现4级以上发作表现，重复注射后, 90%左右的大鼠能够成功点燃，但10%大鼠出现耐受现象,不出现6或7级发作。本实验观察新生大鼠戊四氮反复惊厥1 d和45 d模型的海马神经元形态, 未发现神经元明显凋亡、坏死现象, 与匹鲁卡品以及对照组相比无明显差异,神经细胞计数 CA1、CA3 及门区与对照组也无明显差异,该结果与Planas等［7］的研究相吻合。苔藓纤维发芽是成熟期癫动物模型中普遍存在的现象［8］。本实验中，两个实验组新生鼠点燃后均可以观察到苔藓纤维发芽, 根据苔藓纤维发芽评分标准戊四氮组 CA3 区 Timm 评分明显高于匹鲁卡品组, 差异有高度统计学意义，该结果提示成熟脑和未成熟脑癫痫模型都经历这一病理性改变,表明苔藓纤维发芽的确是癫痫病理生理过程中的重要变化。但癫性发作是否由苔藓纤维发芽所致的突触重组引起,目前尚无明确证据。综合以上指标可以发现，新生鼠致痫后虽无明显神经元丢失，但可见苔藓纤维发芽现象, 表明新生鼠致痫后在无明显神经元缺失的情况下仍存在苔藓纤维发芽, 这至少可以证明神经元坏死并不是苔藓纤维发芽的必要条件。腹腔注射匹鲁卡品小鼠模型是一种理想的颞叶癫痫动物模型，苔藓纤维出芽可作为判断癫痫持续状态模型是否成功的形态学标准。

【参考文献】
  ［1］ 曹亚芹,苏怡凡,陈　虹，等. 戊四氮致痫幼鼠颞叶和海马区突触体素表达及天麻素对其的干预作用［J］.小儿神经基础与临床，2008,23（10）:776778.

［2］ 王本国,廖卫平,罗爱华，等.匹鲁卡品癫痫模型及戊四唑点燃模型的行为学、组织学对比研究［J］.临床和实验医学杂志，2006, 5(3):197199.

［3］ 石秀玉 ,王纪文 ,李兴霞，等. 新生期大鼠反复痫性发作模型的建立［J］.山东大学学报（医学版），2007，45（4）：380383.

［4］　Da Silva G, Correia M, Vital C ,et al.Molecular characterization of bla ( IMP5) , a new integron borne metallobetalactamase gene from an acinetobacter baumannii nosocomialisolate in Portugal［J］.FEMS Microbiol Lett , 2002 , 215(1) : 3339.

［5］　Kosai K, Terayama R , Ikeda T,et al.Local infusion of nerve growth factor attenuates myelinated nerve fiber sprouting in tolamina Ⅱof the spinal dorsal horn and reduces the increased responsiveness to mechanical stimuli in rats with chronic constriction nerve injury［J］.J Anesth, 2001,15:210.

［6］ 姜泊, 张亚历, 周殿元.分子生物学常用试验方法［M］.北京: 人民军医出版社, 1996：1116.

［7］ PlanasAM, SorianoMA, Ferrer I,et al.Regional expression of inducible heat shock protein70 mRNA in the rat brain following administration of convulsant drugs［J］.Brain Res Mol Brain Res,1994,271 :127137.

［8］ 鲁娜 ,黄亚玲 ,李素云,等. 戊四氮反复点燃对发育鼠海马神经元发生的影响［J］.实用儿科临床杂志，2007，22(6)：459455.

作者单位：1 滨州医学院基础学院 滨州市 256603； 2 滨州医学院护理学院