露蜂房纯化蛋白对白血病细胞形态学影响的研究

【摘要】  目的 观察中药露蜂房纯化蛋白Ⅱ(nidus vespae proteinⅡ，NVPⅡ)对人早幼粒白血病细胞株HL60和急性髓系白血病（AML）患者骨髓单个核细胞(BMMNC)形态学的影响。方法 采用体外细胞培养，加入不同浓度NVPⅡ作用于HL60细胞和AML患者BMMNC, 培养72 h后，生长曲线法测定NVPⅡ对白血病细胞增殖的影响，倒置显微镜下观察细胞生长状况,并收集细胞常规制备超薄切片，透射电子显微镜下观察HL60细胞和AML患者BMMNC的超微结构。结果 光镜下NVPⅡ处理组白血病细胞数量明显减少,并出现细胞碎片；透射电镜下，NVPⅡ处理组白血病细胞出现核固缩，染色质浓缩边集，呈新月状、块状或碎裂为质膜包绕的团块，形成凋亡小体；线粒体基质深染，出现空泡样变。结论 NVPⅡ有明显诱导白血病细胞凋亡的作用，并呈现典型的细胞凋亡形态学改变。

【关键词】  露蜂房蛋白；HL60细胞；骨髓单个核细胞；白血病；凋亡

Effect of the purified protein from Nidus Vespae on the morphology of leukemic cell

    SHI Yan  ZHANG Lianshuang  ZHAO Wei  et al

    Department of Histology and Embryology，Binzhou Medical University,Yantai  264003

    【Abstract】  Objective  To observe the effect of the purificated protein from Nidus Vespae(NVPⅡ) on the morphologic changes of HL60 cells and bone marrow mononuclear cells (BMMNC) of acute myeloid leukemia (AML) patient.Methods  Treated cultured HL60 cells with various concentration of NVPⅡfor 72 hours in vitro,using growth curve to detect cell proliferation and using inverted microscope to observe the growth of leukemia cells.Transmission electronic microscope was used to observe the ultrastructural changs of the cells.Results  The number of leukemia cells obviously decreased and cell fragments appeared under light microscope.Under transmission electronic microscope, typical morphological changes of apoptosis were observed among HL60 cells and BMMNC of AML patient in NVPⅡ treated groups, such as nuclear chromatin condensation and marginized to be crescent and formed apoptotic body; hyperchomatin and vacuolar degeneration of mitochondria appeared.Conclusion  NVPⅡ can induce typical morphologic changes of apoptosis of HL60 cells in vitro.

    【Key words】  nidus vespae protein,HL60 cells,bone marrow mononuclear cells,leukemia,apoptosis

    露蜂房为胡蜂科昆虫大黄蜂及同属近缘昆虫的巢，其药用历史悠久，药理作用广泛，近年来发现它对恶性肿瘤有一定的疗效［1］。在临床上，常将露蜂房与其他药物伍用治疗白血病。根据前期实验结果显示，露蜂房中含量较多的蛋白成分可以发挥抗白血病作用［2］。在此基础上，我们应用离子交换层析、透析、冻干等技术对这种蛋白成分进一步纯化，筛选出有效成分并命名为露蜂房纯化蛋白Ⅱ（NVPⅡ），将其作用于人急性早幼粒细胞白血病细胞系HL60和白血病（AML）患者骨髓单个核细胞（BMMNC），并在光电镜下观察其细胞形态学的改变。

    1  材料与方法

    1.1  临床资料  15例急性髓系AML患者，均系2006年10月—2007年1月潍坊市人民医院住院患者，男9例，女6例，中位年龄45(16～48)岁。病程1～180个月，平均26个月。Hb 66～120 g/L，RBC（2.45～4.12）×1012/L，WBC（6.4～78.6）×109/L，PLT（43～99）×109/L。

    1.2  BMMNC的制备［3］  无菌条件下,用骨髓穿刺针从患者髂前或髂后上棘抽取骨髓2 ml,加10 ml ACD抗凝；取10 ml椎形离心管,加入2 ml Ficoll淋巴细胞分离液(相对密度为1.077),水平离心1 000 r/min,10 min后,吸取BMMNC层细胞,用含20%小牛血清的RPMI 1640洗涤2次,通过4号针头过滤；0.4%台盼蓝染色计数活细胞率大于98%。

    1.3  培养条件  人急性早幼粒细胞白血病细胞株HL60由上海第二医科大学血研所惠赠，将分离出的BMMNC和HL60细胞株接种于含10%灭活新生牛血清、100 U/ml青霉素及100 U/ml链霉素的RPMI 1640培养液中，在37℃、含5%CO2饱和湿度培养箱内培养传代备用。加药均在对数生长期内进行。同时设不加药物和生理盐水对照为阴性对照组，每组三个复孔。

    1.4  NVPⅡ溶液的制备  应用离子交换层析、透析、冻干等技术常规制备NVPⅡ溶液。根据临床用药的最大血药浓度配制实验用药浓度。露蜂房口服常用量为12 g，按公式［4,5］计算其临床最大血药浓度为2.50 mg/ml。算出所提取的蛋白总量为3.838 mg，然后换算出每克露蜂房中蛋白成分的含量，得出蛋白成分的最大血药浓度为0.019 19 μg/ml。取1ml NVPⅡ加入DW使体积至100 ml，获浓度为1.919 μg/ml的水溶液。过滤除菌，分装备用。使用时，每毫升培养液内加层析获得的NVPⅡ水溶液1、10、100 μl，即为0.001 919 μg/ml、0.019 19 μg/ml、0.191 9 μg/ml。

    1.5  透射电镜样品制备［4］  72 h后收集培养的各组细胞，0.01M PBS洗3次；3%戊二醛4℃前固定2 h；0.1 M PBS复冲洗2～3次，每次20 min；1%锇酸4℃后固定1 h；4℃ 条件下，常规梯度上行乙醇脱水，Epon812包埋，钻石刀超薄切片，醋酸双氧铀和硝酸铅染色；H7500型透射电镜下观察并拍照。

    1.6  NVPⅡ对白血病细胞增殖影响的检测  取对数生长期HL60和AML患者BMMNC，将细胞密度调整为１×１０５个／ml，接种于９６孔培养板。对照组常规培养，实验组分别加入０.００１ ９１９、０.０１９ １９、０.１９１ ９μg/ml的ＮＶＰⅡ。培养第２４、４８、７２ h用０.４％台盼蓝染色，计数活细胞数。

    1.7  统计学处理  所获数据用ＳＰＳＳ１１.０统计软件进行分析，采用t检验和方差分析，Ｐ＜０.０５为有显著性差异。

    2  结果

    2.1  ＮＶＰⅡ对白血病细胞增殖的影响  ＮＶＰⅡ在体外对ＨＬ６０和ＡＭＬ患者ＢＭＭＮＣ有明显的增殖抑制作用，其抑制强度随ＮＶＰⅡ浓度增加和作用时间延长而增强，见表１、２。表1  NVPⅡ对HL60细胞增殖的抑制作用及不同时间表２  ＮＶＰⅡ对ＢＭＭＮＣ增殖的抑制作用及不同时间  注：*与对照组比较，P＜０.０５

    2.2  光镜观察  相差倒置显微镜下可见：培养第72 h时HL60细胞数量较多，细胞大小均一，呈圆形或椭圆形，核大而圆，占据细胞的大部分（图1）；分离的AML患者BMMNC呈圆形，大小不等，培养第72 h时形成明显的细胞集落(≥40个细胞,图2)。NVPⅡ处理各组细胞生长缓慢，数量明显减少，高浓度组培养第72 h大小不等，形态不一，细胞碎片较多，并出现大量空泡，细胞逐渐溶解死亡（图3、4）。

    2.3  电镜观察

    2.3.1  生理盐水对照组:培养72 h的HL60细胞和AML患者BMMNC，细胞膜完整，细胞器丰富，核糖体较多，核大不规则，核膜完整，核仁明显，染色质呈细颗粒状，均匀分布。细胞质内有散在粗面内质网、高尔基复合体和线粒体（图5、6）。

    2.3.2  NVPⅡ处理组：HL60细胞培养72 h，少数细胞结构正常，大多数细胞超微结构发生典型的细胞凋亡形态学改变。细胞表面微绒毛减少或消失，胞质电子密度降低；凋亡细胞核异染色质浓缩，边集于核膜呈块状，线粒体基质深染，呈现空泡样变及髓样变（图7）；AML患者BMMNC培养72 h，核异染色质浓缩，边集于核膜呈块状或新月形，细胞核固缩、断裂为质膜包绕的碎块，有凋亡小体出现（图8）。

    3  讨论

    露蜂房药用历史悠久，是我国传统的动物中药,其化学成分复杂，药理作用广泛，随着现代科技的进步，露蜂房中的组成物质及有生物活性的化学成分正逐渐被提取分离出来并应用于临床中，为蜂房的临床应用提供了更确切的佐证。近年来我们大量研究发现，露蜂房具有抗白血病的作用，从中提取的蛋白能通过调控白血病细胞凋亡信号转导途径中信号因子的表达发挥诱导凋亡作用［5］。因此，分离提纯露蜂房中有效成分并探讨其作用机制对于其临床应用有很大的价值。

    我们用离子交换层析、透析、冻干等方法对具有抗白血病作用的蛋白粗品进一步纯化，利用体外实验筛选出具有诱导白血病细胞凋亡的有效成分命名为NVPⅡ，然后绘制生长曲线测定NVPⅡ对白血病细胞增殖的影响，并用倒置显微镜和透射电子显微镜观察它对HL60细胞和AML患者BMMNC形态结构的影响。结果显示，未经NVPⅡ处理的白血病细胞生长旺盛，细胞内各种细胞器较发达。而NVPⅡ处理组白血病细胞大多数超微结构呈现典型的细胞凋亡形态学改变，核染色质浓缩、边集，呈新月形或环状；细胞核固缩碎裂呈块状。通过以上实验发现，NVPⅡ可以使白血病细胞增殖受抑制，并使其超微结构发生典型的凋亡改变，其诱导凋亡的机制有待于进一步研究。

【参考文献】
  　　［1］ 李彦,贾恩礼,栾琳.蜂房药理作用研究进展［Ｊ］.中医药信息，2004,21(5)：2122.

［2］ 辛先贵，张圣明，张春燕，等. 中药露蜂房蛋白对人红白血病K562细胞影响的实验研究［J］.电子显微学报，2005,21(6):764.

［3］ 张圣明,陈红霞,于民海,等.生长抑素对白血病细胞增殖影响的免疫组织化学研究［J］.中国组织化学与细胞化学杂志,2002,11(4):393398.

［4］ Steube KG,Gignac SM,Hu ZB,et al.In vitro culture studies of childhood myelodyspastic syndrome: establishment of the cell line MUTZ1［J］.Leuk Lymphoma ，1997,25(34):345363.

［5］ 辛先贵，张圣明，时彦，等.中药露蜂房蛋白对人红白血病K562细胞增殖的影响［J］.解剖学报，2006,37(1):7477.

(收稿日期:20090112)

作者单位：1 滨州医学院组织学与胚胎学教研室 烟台市 264003；2 滨州医学院病理学教研室