小儿再生障碍性贫血发病机制的研究进展

【关键词】  再生障碍性贫血; 儿童; 发病机制

再生障碍性贫血(aplastic anemia, AA)是一组由化学、物理、生物因素及不明原因引起的骨髓造血干细胞及造血微环境损害,骨髓造血衰竭及血中全血细胞减少的疾病。亚洲国家AA发病率为(3.9～5.0)/106 ，明显高于欧美国家的(2.0～2.7)/106[1]。多数学者认为AA发病与机体免疫功能的紊乱、造血干/祖细胞的内在增殖或分化缺陷和造血微环境的系统异常等有关。本文就近几年有关小儿AA发病机制的研究进展作一综述。

　　1 基因水平异常

　　1.1 人类白细胞抗原(HLA)DR频率异常 多项研究表明成人AA患者HLADR2出现频率高于正常人;HLADRB1*1501频率增高尤其显著，是AA患者HLADR2占优势的最主要因素。不过Fuhrer等[2]在对181名AA患者的研究中表明儿童SAA与HLAB14阳性相关(P=0.0039 )，而与HLADR2无相关。在一项对103名日本AA儿童的研究中，同样未发现患儿HLADR15频率存在有意义的增高[3]。这些均提示儿童与成人HLA类型AA易感性可能存在差异。但最近一项研究则报道HLADRB1*1501出现频率与成人和儿童AA均有显著相关[4]。

　　1.2 免疫调节因子基因多态性 肿瘤坏死因子α(TNFα)与γ干扰素(IFNγ)是人体内重要的免疫调节因子，根据TNFα基因启动子308位点碱基替换的多态性，将其分为TNF1(-308G)和TNF2(-308A)两类;编码IFN基因的VNDR (variable number of dinucleotide)定位于IFNγ基因第一内含子1 349位点上。已有研究报道VNDR基因多态性与儿童AA的发生显著相关。Gidvani等[5]采用PCRRFLP方法检测73例获得性AA患者6种不同细胞因子基因单核苷酸多态性，发现TNFα及IFNγ高产率型基因频率较正常数据显著增高，此研究进一步证明TNFα和IFNγ VNDR基因的多态性与AA遗传易感性有关。

　　1.3 端粒酶基因突变 端粒酶决定的端粒长短与很多疾病的发生密切相关，并且端粒长度随着分裂次数的增多而逐渐缩短。端粒过短将导致其增殖能力衰竭、异常免疫攻击耐受性降低及其染色体不稳定性增加。TERC是编码端粒酶RNA的基因，正常人有同样的TERC基因。研究发现AA的发病与端粒酶基因突变有关，但是在Field等[6]及Liang等[7]的研究中，均未发现AA患儿存在有意义的TERC基因突变。这表明成人与儿童AA发病机制可能存在差异，关于端粒酶基因突变与小儿AA的关系尚有待进一步研究。

　　2 天然免疫异常

　　Toll样蛋白受体(Tolllike receptor,TLR)主要分布在单核细胞、淋巴细胞及树突细胞等，它能识别脂蛋白抗原，参与天然免疫反应。TLR能特异的与其配体结合，通过NFκB途径或经由其它通路导致细胞凋亡。与正常人比较，AA患者CD4+ 细胞的TLR基因上调[8]。国外学者曾报道AA患者体内自然杀伤(NK)细胞不但数量持续性地增加，活性也有所增加，并且数量会随着造血恢复和疾病的复发而有所改变。NKT细胞是淋巴细胞的一个亚类，表达恒定的T细胞受体，包括Vα24 JαQ和常见的NK细胞表面标记，NKT缺陷与多种人类自身免疫性疾病有关。NKT细胞可以抑制T细胞向Th1细胞的分化。已有研究表明AA患者体内的NKT细胞明显减少，它们的缺陷可能在AA的局部免疫破坏中起到一定的作用。PRFI基因编码穿孔素，后者主要表达于细胞毒性T细胞(CTL)和NK细胞，通过非Fas机制杀伤靶细胞。国外学者最近报道AA患者存在PRF1基因突变[9]。存在PRF1基因突变的AA患者，其活化的CTL和NK细胞胞质内穿孔素蛋白水平明显减低甚至缺失，溶细胞作用也明显减弱，对抗原提呈细胞杀伤力下降。该基因突变使得抗原刺激持续存在，进而导致CTL不断增殖和活化。虽然目前针对小儿AA天然免疫异常方面的研究鲜有报道，但是以上研究提示天然免疫异常在AA的发病过程中发挥一定的作用。

　　3 细胞免疫异常

　　国内外学者对AA患者细胞免疫异常方面的研究较为深入，众多研究表明CTL所介导的免疫异常是AA患者骨髓衰竭的主要环节，强化免疫抑制治疗对AA的显著疗效也成为其有力的证明。

　　3.1 T细胞及其亚群数量和表型的异常 正常生理状态下，CD4+、CD8+T细胞对维持机体的免疫平衡起重要作用。CD4+T细胞根据其调节功能不同分为辅助T细胞(Th)和抑制性T细胞(Ts);CD8+T细胞根据其分泌的细胞因子谱分为Tc1和Tc2。有学者对AA患儿与正常儿童外周血淋巴细胞表型进行对照分析，发现AA患儿CD4+细胞减少，CD8+细胞显著升高，CD4+/CD8+比值减小;Th1和Tc1水平明显增高，Th1 /Th2和Tc1 /Tc2比值也明显增高,并且与发病的严重程度有关[10]。

　　T细胞的一个亚群，调节T细胞CD4+CD25+ T细胞(regulatory T cells, Tregs)，可抑制自身反应性T细胞，在自身免疫性疾病的发展与进程中起重要作用。Solomou等[11]研究发现AA患者Tregs数量与正常人相比明显下降，而作为Tregs发挥功能的重要转录因子FOXP和NFAT1 mRNA表达也有所下降。在一项在对免疫介导小鼠骨髓衰竭模型的研究中发现，Tregs的比率在小鼠体内是增高的，但是其细胞内不表达FOXP3，所以Tregs无法正常发挥其免疫抑制作用[12]。Chen等[10]的研究则发现特发性AA患儿外周血中与淋巴细胞活化相关的膜分子CD25+表达水平较正常对照组显著增高，但CD4+CD25+T细胞表达水平和CD4+CD25+/CD4+比值无明显差异。这些研究均表明，Tregs在AA发病中发挥重要作用，但是Tregs的数量变化及其确切作用机制和作用效果尚有待临床进一步研究。

　　3.2 T细胞的免疫激活及其调节的异常 CD69为T细胞激活标志,SAA患者CD4+和CD8+细胞及慢性AA (CAA)患者CD8+细胞在受植物血凝素(PHA)刺激前CD69表达率高于正常对照, 受PHA刺激后CD69表达率更明显增高,尤以CD8+细胞群变化明显[13]。这说明AA患者的T细胞处于预激活状态,对外来刺激的激活潜能大。Th1、Tc1细胞分泌Ⅰ型因子IFNγ和IL2 ,Th2、Tc2细胞分泌Ⅱ型因子IL10及IL4,两型细胞通过各自分泌的细胞因子互相抑制, 比如IL10有抑制IFNγ和TNFα的作用。

　　3.2.1 T细胞在抗原刺激下克隆性增殖：T细胞受体β链可变区(TCRVβ)的互补决定区(CDR3)序列是T细胞克隆的区分标志，Vβ家族的优势CDR3基因型代表相应的疾病特异性T细胞克隆[14]，表现为Vβ和CDR3偏颇。正常的CDR3分布呈高斯曲线,通过分子免疫学实验发现，成人AA患者此曲线出现数个单克隆或寡克隆明显增殖[15]。de Vries等[16]发现AA患儿的TCR Vβ偏态分布的程度明显高于健康对照组，免疫抑制治疗后，趋向于正态分布。有学者研究AA患者体内占优势的Vβ的习惯性分布，发现CD4+Vβ亚家族中，仅仅有38%存在偏移曲线且主要是CDR3的多克隆分布;相对的CD8+Vβ亚家族中，有82%存在偏移曲线并多为CDR3的寡克隆分布。由此可推测，多克隆T细胞被高度扩张的寡克隆淋巴细胞取代是AA发病起始阶段的主要致病原因之一，CD8+CTL是导致骨髓衰竭的主要的效应细胞，这些细胞的增殖可能由自身细胞抗原以共同的机制诱导。

　　3.2.2 CD4+细胞对T细胞分化的调节：AA患者Th和Tc细胞都向Ⅰ型细胞分化, CD4+细胞在这种调节中的作用突出，它通过TLR发挥其调节作用。Zeng等[8]通过基因芯片的方法研究发现，与正常人相比AA患者CD4+细胞上TLR表达增加，其中TLR1、TLR2及TLR6的表达尤为显著。TLR活性增加就会触发细胞因子的释放，它可诱导IFNγ、TNFα释放并激活共刺激信号，促使T细胞向Th1方向分化，Th1/Th2失衡，诱导Th1细胞的适应性免疫应答，这一系列变化均与AA的发生相关。

　　3.2.3 T细胞转录因子Tbet对T细胞分化的调节：Tbet (Tbox expressed in T cell)是转录因子Tbox家族中的一员，作为专一性的IFNγ基因的反式激活剂，它能特异性地促进Th0向Th1分化并抑制Th0向Th2分化，并诱导已分化的效应性Th2重新向Th1转化，是Th1细胞分化和发挥功能的关键性调节因子。AA患者的T细胞上存在Tbet蛋白的高表达[17]，Tbet能够在没有任何前期刺激的情况下直接与IFNγ的启动子结合，诱导其转录。Tbet的高表达与细胞内的IFNγ和IL12R水平相关，还与疾病的严重程度相关。

　　4 体液免疫异常

　　尽管有证据表明AA是一种T细胞介导的自身免疫性疾病，但至今还没有明确的目标自身抗原被发现。通常自身抗原不仅引起T细胞克隆性增殖和细胞免疫功能紊乱，同时也可引起B细胞介导的体液免疫紊乱。Hirano等[18]用重组cDNA表达文库的血清学分析技术，用AA患者血清对人类胎肝cDNA文库进行筛选，其研究结果表明kinectin可能为AA患者体内的一种自身抗原，同时也证明AA患者体内存在体液免疫的异常。近年又发现3种新的AA潜在靶抗原，PMS1[19]、DRS1[20]和膜突蛋白[21]，但是它们在AA发病机制中的作用及其与小儿AA的关系尚待进一步阐明。

　　5 造血负调控因子分泌异常

　　众多的造血负调控因子是目前AA发病机制研究的热点。IFNγ，TNFα，转化生长因子β(TGFβ)，IL2、6、8、12、15、18和NO及一些黏附分子均对造血起负性调控作用。TNFα能抑制细胞克隆的形成，亦能增强T细胞、NK细胞的细胞毒作用;能使淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞增多且功能增强;能诱导NO合成，抑制骨髓造血细胞的增殖分化;可上调CD34+细胞表面Fas抗原，加速CD34+细胞凋亡，从而加速骨髓衰竭。IFNγ可诱导单核细胞、巨噬细胞、树突细胞等MHCⅡ类抗原的表达，使其参与抗原提呈和特异性免疫识别过程，增强抗原提呈细胞和T细胞的相互作用;可诱导细胞表达IL2受体，从而促进T细胞增殖，损伤造血祖细胞;可在多种细胞中诱导一氧化氮合酶(NOS)的合成，从而使集落形成受到限制，NOS可直接导致骨髓造血细胞凋亡。Dubey等[22]研究发现，AA患者骨髓中IFNγ，TNFα表达水平较对照组显著增高，并且骨髓中CD3+IFNγ+细胞比例增高;在应用ATG+CSA治疗后，其表达水平均降低。此研究表明骨髓中IFNγ，TNFα的高表达可能促进了AA的发病。

　　6 造血干/祖细胞的缺陷

　　大量研究资料提示，AA患者造血干/祖细胞(HSC/HPC)存在质和量的缺陷。其质的缺陷可能存在一定程度的遗传倾向，并导致AA与克隆性疾病如阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)及骨髓增生异常综合征(MDS)临床表现上的重叠性。CTL可通过细胞毒作用直接杀伤HSC;造血抑制因子则通过一些信号途径诱导HSC凋亡，现发现的主要有Fas和FasL途径, NO途径和IL1B过转化酶途径。有学者研究发现AA患儿骨髓HSC/HPC缺陷主要表现为HSC/HPC细胞数量降低,尤其是CD34+ CD38-早期HPC显著减少;HSC/HPC凋亡增加;CD34+细胞表达系分化抗原增加和HPC增殖能力下降，其研究提示T细胞免疫功能紊乱引起的HSC/HPC凋亡增加在儿童AA骨髓造血功能衰竭中起关键作用。

　　7 骨髓间充质干细胞的异常

　　骨髓间充质干细胞(MSC)在体内外均可发挥免疫抑制作用，并可通过介导HSC粘附，分泌多种造血生长因子而发挥造血支持作用，其中干细胞因子(stem cell factor，SCF)能够刺激原始造血细胞增殖分化，在一定水平上反映骨髓基质的造血调控作用。已有研究报道成人AA患者MSC的抑制T细胞增殖能力及其释放细胞因子的水平均较正常对照降低。有学者研究发现AA患儿骨髓MSC支持骨髓单个核细胞(mononuclear cells, MNC)体外扩增的能力显著降低，并且细胞培养上清中SCF浓度显著低于对照，其研究进一步表明AA患儿骨髓MSC增殖能力减低与其分泌SCF减少有关，为骨髓MSC在儿童AA发病机制中的作用提供了线索。但是在Xu等[23]的研究中未发现AA患儿存在MSC免疫抑制缺陷，有关MSC与AA患儿发病机制的关系有待于进一步探究。

　　综上所述,小儿AA的发病机制极其复杂，细胞免疫异常是AA患儿骨髓造血功能衰竭的主要环节，Tregs、Tbet 及TLR等均对T细胞分化及其调节发挥重要作用。T细胞的免疫异常又引发了一系列变化，如IFNγ，TNFα等造血抑制因子分泌的增多，HSC/ HPC凋亡的增加等，这些均参与了骨髓衰竭的发生。以上机制的阐明为临床小儿AA的诊断和治疗提供了重要思路。随着科研的进展，相信小儿AA的发病机制将得以更详尽的阐明。

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