干细胞移植治疗视网膜色素变性研究进展

【关键词】  视网膜色素变性;干细胞移植;视网膜干细胞

视网膜色素变性(RP)是一组遗传性退行性视网膜疾病，主要影响视杆细胞和视网膜色素上皮细胞(RPE)。早期特征性临床表现为夜盲和周边视野的丧失，最终导致中心视力的丧失，目前尚无有效治疗方法。近年来干细胞移植治疗视网膜色素变性取得了一些进展，下面就对其进行综述。

　　1 胚胎干细胞移植

　　胚胎干细胞为源于受精胚泡的内细胞团,具有多能性,能够自我更新并产生特殊类型的细胞[1]。其可以发育成外胚层、中胚层及内胚层任何组织类型的细胞,在特异性组织环境中,能分化成特定类型的细胞[2]。

　　1.1 胚胎干细胞诱导分化为视网膜前体细胞 胚胎干细胞分化必须依靠相应微环境所提供的各种营养因子来完成。Sugie等[3]利用维甲酸法将EB3鼠的胚胎干细胞与胚胎第6天的鸡胚视网膜组织联合培养10 d后,发现视紫红质免疫阳性细胞明显增加,而对照组中则未发现视紫红质免疫阳性细胞。Ikeda等[4]应用改良的无血清培养法(SFEB/DLFA),高效诱导出Rx+/Pax6+视网膜前体细胞,对这种细胞进行视锥视杆同源盒基因转染后,细胞还可以自体激活,获得了表达视紫红质的能力。有学者对培养方法进行改良,采用经典培养方法或非经典培养方法与多种生长因子、新生胚胎视网膜组织或视网膜基质细胞联合培养胚胎干细胞,使干细胞定向诱导的特异性及诱导效率均有明显提高[5，6]。

　　1.2 供体视网膜前体细胞与受体视网膜组织作用的可能机制 研究表明,细胞之间有相互识别和选择性黏着的能力,同类细胞间相互识别并黏着,形成细胞群体,不同细胞群体之间按一定的规律排列,这种细胞行为称为细胞类聚。细胞类聚在胚胎发育中具有重要作用,在视网膜前体细胞眼内移植的研究中,这一现象也已得到证实。Ikeda等[7]在器官培养中也观察到类似的现象,他们发现，体外培养的胚胎干细胞源性视紫红质阳性细胞准确无误地进入光感受器细胞层并存活;Ikeda等提出了另外的解释,他认为未成熟的视网膜前体细胞可能在进入外核层后,优先分化为光感受器细胞。这两项研究都证实了细胞类聚在干细胞眼内移植中的作用。同源细胞之间的亲和力导致细胞类聚,对干细胞在视网膜内的定向迁移具有重要意义。

　　2 骨髓干细胞移植

　　骨髓干细胞(BMSC)主要由骨髓造血干细胞(HSCs)和骨髓间充质干细胞(MSCs)两大部分组成。HSCs是具有高度自我更新能力和多向分化潜能的造血前体细胞,主要生成血液的有形成分;MSCs 则生成骨髓间质成分和分泌细胞因子支持造血。大量研究证明HSCs 能向非造血细胞,如肝脏细胞、心肌细胞、神经细胞和血管内皮细胞分化;MSCs 也具备向骨、软骨、脂肪、肌肉细胞以及心肌细胞、肝细胞、内皮细胞、神经细胞分化的能力[8，9]。

　　2.1 自体骨髓干细胞移植后的视网膜组织学观察 Kicic等[10]用BrdU标记MSCs后在4～5周龄的RSC大鼠视网膜下注射,形成覆盖1/3视网膜面积的视网膜下水泡,4 d左右能完全吸收;注射后12周,发现植入的MSCs在注射区域分布,不能向外迁移,但在此区域范围内可以越过光感受器节细胞层在外核层与宿主视网膜整合。免疫组化分析,移植的MSCs视紫红质、突触(小) 泡蛋白染色阳性,并且不表达增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen ,PCNA)。电镜下可以观察到MSCs周围有突触小泡形成。说明MSCs移植后向光感受器细胞分化的能力,并有可能帮助形成突触传递。

　　对于机械损伤、激光损伤或MNU诱导的RP模型,认为BMSC不管是眼内注射或静脉注射移植,植入的BMSC均在视网膜损伤部位的外核层整合,并能表达神经细胞胶质酸性蛋白、视紫红质蛋白和波形蛋白等视网膜神经细胞特异蛋白[11,12]。其中,Minamino等[12]将观察时间延长至一年,仍能检测到BMSC来源的神经细胞。

　　2.2 自体骨髓干细胞移植治疗RP的可能机制

　　2.2.1 细胞分化：BMSC可塑性的发现使人们开始研究其在RP的治疗上能否发挥作用。在体外无论有无诱导因素,均有BMSC 向多种细胞分化的报道[13]。实验证实,将BMSC眼内移植或经静脉移植,均可发现BMSC与视网膜整合,多数报道整合于外核层,亦有报道在节细胞层[14]。免疫组化分析发现,整合的细胞能够表达视网膜神经细胞和视网膜光感受器细胞特异性蛋白,如神经细胞胶质酸性蛋白、视紫红质蛋白和波形蛋白等,说明BMSC移植后能够在RP动物模型的视网膜存活,并可以向视网膜神经细胞和视网膜光感受器分化,从而达到治疗RP 的目的。

　　2.2.2 抑制凋亡：Martin Friedlander及其研究组报道HSCs对外核层产生的保护作用可能与凋亡抑制相关[15]，将玻璃体腔植入HSCs的rd1Prd1小鼠视网膜做基因序列分析,发现多数增量调节的基因编码的蛋白具有抑制细胞凋亡的作用,如Tgtp 、H2K2、MAD、Cxadr 、YY1 等,它们可能在延长感光细胞寿命上起重要的治疗作用[15]。cmyc是参与细胞凋亡的转录因子,它可以增量调节下游区的凋亡诱导因子。研究发现cmyc在rd小鼠的表达是野生型的4～5倍。Mad1和YY1具有抑制cmyc的活性,阻止cmyc诱导的凋亡的作用。Martin Friedlander 的实验中Mad1和YY1在LinHSCs植入的视网膜有显著高表达。Mad1的高表达还可能通过抑制凋亡途径中的另一重要成分,即抑制Fas诱导的半胱天冬酶的激活来达到抑制凋亡的目的[15]。

　　3 视网膜干细胞移植

　　眼组织通过中央神经系统的祖细胞、前体细胞、视网膜干细胞途径，达到视细胞的再生。哺乳类动物视网膜干细胞在成年后很少具有活性，如何在体外培养视网膜干细胞,控制其增殖和分化,并且利用组织工程的方法体外构建视网膜,移植治疗相关视网膜疾病,是对视网膜干细胞研究的最终目的。但是从目前来看,如何大量扩增视网膜干细胞细胞,还是研究中瓶颈之一。

　　3.1 视网膜干细胞增殖分化培养的突破 最近Kumar[16]将干细胞生物反应器引入了视网膜细胞的培养中，生物反应器模拟了干细胞在动物体中所处的环境条件,让细胞处在一种富含蛋白质的液体里,模拟体内循环系统的流动,大大提高了干细胞培养的增殖率,并且研究人员还可以通过改变生物反应器中的细胞营养,控制干细胞的分化。实验发现生物反应器促进了细胞与细胞之间的相互作用,在各种有丝分裂原的作用下,可以构建出三维结构的视网膜组织,并且出现一定程度的细胞分化，可见这种新技术为视网膜干细胞培养研究带来了新的突破。

　　3.2 视网膜干细胞增殖和定向分化的机制研究

　　3.2.1 细胞内部的调节因子：干细胞处于分裂M期后,如果不再进入新的细胞增殖循环,就将进入分化过程。Zhang[ 17]通过多种基因研究的方法在新生小鼠视网膜中发现了增殖中的视网膜干细胞和分化而来的视杆细胞,都有Rb蛋白的表达,然而在Rb基因缺失的动物中,只有视网膜干细胞,而没有成熟分化的视杆细胞,说明Rb蛋白对视杆细胞增殖和分化有着很重要的作用。Rb蛋白通过与细胞周期蛋白激酶复合物(CDKs)的作用来改变磷酸化状态。当Rb蛋白的磷酸化被阻滞时,细胞退出细胞周期,发生增殖抑制,分化促进。而阻滞磷酸化进行的主要因子是细胞周期蛋白激酶抑制因子(CDKIs)。其中p27(Kip1)和p57(Kip2)均属于CDKIs中的一种,也是目前为止发现与视网膜发育关系最密切的两个因子。有文献报道[18]在细胞周期的G2晚期/G1早期, p27(Kip1)上调,视网膜发育中的细胞周期蛋白D1 (cyclinD1)出现下调。在p27(Kip1)或p57(Kip2)基因缺失的小鼠中,视网膜干细胞会出现不断分裂增殖直至大部分凋亡,却没有成熟分化的视网膜细胞出现。

　　3.2.2 细胞信号传递系统的作用：在调节干细胞向预定细胞分化的研究过程中,有两个细胞外控制信号, 即转化生长因子(TGFβ)家族和Wnt家族,它们都有可能参与了视网膜干细胞的增殖和分化过程。Anchan[19]提出TGFβ是视网膜干细胞在体外生长的有丝分裂原的观点。Wnt是一类分泌型糖蛋白,它的膜受体Frizzled是细胞膜上的一种具有7次跨膜结构的卷曲蛋白,它们共同组成Wnt/Frizzled信号通路。该信号通路激活以后可以阻断β2连锁蛋白(β catenin)的降解,引起β catenin在细胞质中的积累进入细胞核,再与T细胞因子相互作用,调节靶基因(如cyclin D1)的表达,从而达到调节细胞增殖分化的目的[20]。Kubo[21]在动物实验中发现,睫状体区(CMZ)是整个视网膜中Wnt2b(Wnt13)表达最高的区域,与之相应的Wnt蛋白受体Frizzled4和Frizzled5也有表达, Wnt信号通路的下游转录因子LEF1也呈现高表达。当阻断此信号通路时, CMZ中的干细胞分化成为了神经元和神经胶质细胞。体外实验结果与动物实验结果一致。并由此得出了Wnt家族分子参与视网膜干细胞增殖分化的结论。Das和Inoue[22，23]同样通过实验得出了Wnt信号通路与CMZ中视网膜干细胞的增殖分化有关的结论。

　　4 干细胞移植影响因素

　　干细胞移植能否成功依赖于细胞迁移及整合进入宿主中枢神经系统的能力,与干细胞的来源及培养条件也有关。干细胞自身的特性、细胞生存的微环境以及宿主视网膜的健康状况对神经干细胞的命运可能具有决定作用[24] 。

　　4.1 干细胞自身特异性基因对眼内移植的影响 供体干细胞的迁移能力与干细胞自身携带的特异性基因有关。Tabata等[25]利用电造孔法将外源性Rx/rax基因导入鼠胚胎干细胞中,对其进行诱导分化,并与鼠视网膜组织进行联合培养,发现不表达Rx/rax的干细胞只在视网膜表面聚集成团,并不出现视网膜内迁移,而不表达Rx/rax的干细胞在培养后能移行至胶质细胞层及内核层,形成突起样结构,3周后,细胞充满于内核层及外丛状层,并表达胶质细胞及水平细胞标志。未分化的不表达Rx/rax的干细胞,则不发生迁移。这表明,异常基因Rx/rax在胚胎干细胞中表达后,能够发出某种指令,改变胚胎干细胞的属性,使其向视网膜神经元分化,迁移到宿主视网膜细胞内并能表达视网膜亚群细胞标志。

　　4.2 视网膜的健康状况对眼内移植的影响 在神经变性性疾病中,神经元持续性死亡,正在死亡的宿主细胞可能激发有利于干细胞移植的环境信号, 从而有利于干细胞的移植。Meyer等[26]将绿荧光蛋白标记的鼠胚胎源性神经前体细胞分别移植到正常C57BL/6J鼠、伴有早期快速视网膜变性的rd1基因突变鼠以及视网膜变性进展缓慢的mnd基因突变鼠玻璃体内,观察干细胞移植后的不同效果。结果发现，在正常C57BL/6J 鼠眼内,供体干细胞不发生视网膜内迁移;而在rd1及mnd基因突变鼠眼内,供体干细胞均发生视网膜内迁移,mnd基因突变鼠视网膜内细胞迁移的程度明显超过了rd1鼠。他们认为变性的视网膜能够释放出诱导供体细胞向视网膜内迁移和分化的信号,信号的强弱与视网膜的变性程度有关,而健康的或变性末期的视网膜不能发出信号,吸引供体细胞移向视网膜或同视网膜发生联系。未被破环的视网膜还可以通过玻璃体阻止移植的细胞迁移。

　　5 小结

　　虽然干细胞的研究已经取得了令人瞩目的成就,但是仍然存在许多问题,如何控制干细胞向特定类型的细胞转化，分化后的细胞在宿主内是否具有致瘤性，如何获得组织工程所需要的种子细胞的数量等,都有待于进一步研究。在视网膜发育过程中,有许多机制也需要我们进一步阐明。正因为如此,干细胞移植治疗视网膜色素变性真正应用于临床尚需相当长的时间,但是作为一种新型的治疗方法,干细胞移植仍然显示出良好的前景。

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