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【摘要】 目的 研究甲醛染毒对大鼠脑组织超氧化物歧化酶( SOD)和脑细胞DNA损伤的影响。方法 采用腹腔注射方式给大鼠染毒，15只大鼠随机均分为对照组(生理盐水)、低剂量甲醛组0.2 mg /kg(1/ 2000 LD50)、高剂量甲醛组20.0 mg/kg(1/ 20 LD50);每天1次，染毒7 d。染毒结束后，检测大鼠脑组织SOD的含量，利用单细胞凝胶电泳技术(彗星实验)检测脑细胞DNA损伤。结果 高剂量染毒组大鼠脑组织的SOD 的活力[(12.89±2.12)U/mg Pro]低于对照组[(16.34±2.68)U/mg Pro] (P<0.05) ;腹腔注射甲醛可导致脑细胞DNA片段断裂，高剂量甲醛组彗星尾巴明显长于对照组。结论 甲醛可使脑组织SOD 活力下降，造成脑细胞DNA 的断裂;甲醛对大鼠中枢神经系统具有一定的毒性作用。
【关键词】 甲醛;超氧化物歧化酶;DNA;单细胞凝胶电泳
Effects of formaldehyde on superoxide dismutase in cerebral tissues and DNA damage of brain cells of rats
YU Xuefei WANG Zhen WANG Jiao GAO Meng HE Mengya FENG Dan ZHAO Dongmei
College of Basic Sciences，Binzhou Medical University，Binzhou 256603
【Abstract】 Objective To study the effect of formaldehyde on superoxide dismutase(SOD) in the cerebral tissues and DNA damage of brain cells of rats.Methods The rats in control group were exposed to 0.9 % NaCl at 0.1 ml/ 10 g,the rats in low and high dose groups were exposed to formaldehyde with 0.2 and 20.0 mg/kg,once per day for seven days.Then SOD in the cerebral tissues were tested, and single cell gel electrophoresis technique (comet assay) was used to test the DNA damage of the brain cells.Results The activity of SOD in high dose group [(12.89±2.12)U/mg Pro] showed a significant decrease compared with control group [(16.34±2.68)U/mg Pro](P<0.05).Formaldehyde could significantly cause the break up of the DNA strands.The tail of comet in high dose group was longer than that in control group.Conclusion Formaldehyde can decrease the activity of SOD in cerebral tissues, and cause break up of DNA strands.Formaldehyde has obvious toxic effects on central nervous system in rats.
【Key words】 formaldehyde，superoxide dismutase，DNA，single cell gel electrophoresis technique
甲醛存在于多种工业及民用产品中，是一种重要的环境污染物。甲醛对心血管系统、内分泌系统、消化系统、生殖系统、肾脏均具有毒性作用，并具有一定的遗传毒性和神经系统毒性。大量的流行病学研究显示长期接触甲醛可引起注意力不集中、神经衰弱、头痛、头昏等神经系统症状[1]，动物实验也提示甲醛可抑制中枢神经系统活动，导致神经行为功能异常，影响学习记忆。本实验采用腹腔染毒的方法，观察甲醛对大鼠脑组织超氧化物歧化酶( SOD) 活力和脑细胞DNA损伤的影响，为进一步证实甲醛的神经毒性提供依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物 选择健康清洁级纯系大鼠30只，鼠龄7 周，体质量181～223 g，全部雌性，由山东绿叶制药股份有限公司实验动物中心提供，在屏蔽环境中进行饲养，饲养条件: 温度( 24±2) ℃，相对湿度( 55±10)%。
1.2 试剂与仪器 试剂：甲醛(AR 级，中国展望化工试剂厂)，超氧化物歧化酶( SOD) 测定试剂盒(南京建成生物工程研究所),蛋白酶K(上海浩然生物技术有限公司)， 正常熔点琼脂糖(上海化学试剂公司)，低熔点琼脂糖(德国Premega公司)，DAPI(中科瑞泰生物科技公司)，0.4%苔盼蓝溶液(美国Sigma公司)，其他试剂均为分析纯。仪器：荧光分光光度计(F4500，日本日立)，DYYⅢ型电泳槽(北京市六一仪器厂)，DYYⅡB 型三恒电泳仪(北京市六一仪器厂)，BH2 型荧光显微镜(日本OLYMPUS)，0.635 cm、450 万相素数码相机(日本Nikon)，三用电热恒温水箱(北京长源实验仪器厂)。
1.3 方法
1.3.1 动物分组与染毒：30只大鼠随机均分为对照组和高、低剂量染毒组，每组10只，全部雌性。采用腹腔注射方式给大鼠染毒，染毒组剂量分别为：低剂量甲醛组0.2 mg/kg(1/ 2000 LD50)和高剂量甲醛组20.0 mg/kg(1/ 20 LD50)，对照组同时腹腔注射生理盐水，每天染毒1次，连续7 d。
1.3.2 脑组织超氧化物歧化酶(SOD)测定：染毒结束后，每组处死5只大鼠，立即在冰台上取脑组织，称重，在冷生理盐水中漂洗，滤纸拭干，用生理盐水制成10%匀浆。2 000 r /min(离心半径6.5 cm)离心10 min，取上清液，按试剂盒说明书进行操作，采用UV7502紫外可见分光光度计测定脑组织中SOD活力，蛋白定量采用双缩脲法。
1.3.3 脑细胞悬液制备：将每组另外5只大鼠腹腔麻醉，迅速取脑，用眼科剪剪成糜状(约1 mm3 的组织块)，两层滤纸过滤。将细胞滤液1 600 r /min 离心5 min，用PBS 重新悬浮离心管底的细胞，并调整细胞密度。苔盼蓝排斥法检测细胞活力，细胞存活率接近90%，细胞密度为105～106 个/ml。细胞吹打均匀后，向每个1.5 ml 的离心管中各加0.5 ml 脑细胞，在37℃的水浴中孵浴60 min。
1.3.4 彗星实验步骤：①制备第一层胶：100 μl 0.8%正常熔点琼脂糖，加盖盖玻片，4℃固化10min;②制备第二层胶：轻轻地去除盖玻片，在第一层胶上滴加75 μl含1×10 000个细胞的0.6%低熔点琼脂糖(细胞与凝胶比例为1∶5)，加盖盖玻片，4℃固化10 min;③在第二层凝胶上铺75 μl 0.6%低熔点琼脂糖;④裂解：去掉盖玻片，将凝胶浸入冰冷的中性裂解液内(临用前加10% DMAO，1%Triton X100)，4℃裂解1 h;⑤取出玻片，用PBS缓冲液漂洗3次后置于水平电泳槽内，加入pH 8.5的电泳缓冲液(没过玻片2～3 min)，放置20 min(黑闭);⑥电泳：电压20 V，300 mA，30 min;⑦取出玻片，用PBS，pH 7.5漂洗3次，每次3 min;⑧染色：用DAPI染色5 min, 双蒸水洗掉表面的染料，24 h 内在荧光显微镜下观察。
1.4 统计学处理 彗星实验结果应用Comet score 软件分析尾相( TM )，数据用x±s表示，应用SPSS13.0 软件进行单因素方差分析和 Dunnett检验进行比较。
2 结果
2.1 甲醛对大鼠脑组织SOD活力的影响 对照组、低、高剂量组大鼠脑组织的SOD 活力分别为(16.34±2.68)、(14.87±2.76)和(12.89±2.12)U/mg Pro，与对照组比较，甲醛染毒组小鼠脑组织SOD活力均有下降趋势。高剂量组与对照组差异有统计学意义(P<0.05)，其他各组之间差异无统计学意义(P>0.05) ，详见表1。表1 各组脑组织的SOD 活力比较
2.2 彗星实验结果 对照组荧光染色后核DNA基本集聚星圆形;染毒组脑细胞由于受到DNA断裂剂(甲醛)的损伤，核DNA所产生的断片在电场力的作用下向阳极移动，经荧光染料染色后，形如彗星，见图1,高剂量甲醛组彗星尾巴明显长于对照组。
3 讨论
近些年，含有甲醛的物质被广泛应用，国内外调查显示，甲醛是当今重要的环境污染源。大量的动物实验和流行病学调查都显示甲醛可引起人和动物出现神经行为的异常，具有显著的神经系统毒性[1～5]。
甲醛对神经系统的毒性作用与其造成的脂质过氧化损伤有关。大量的研究显示，甲醛暴露浓度达到一定水平时，可以引起脑组织的脂质过氧化，造成脂质过氧化产物增多[6];另外，甲醛能降低神经组织内谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化物歧化酶的含量，升高丙二醛浓度[6，7]，降低细胞内谷胱甘肽的含量，使细胞的抗氧化应激能力下降[8]。本实验采用腹腔染毒的方法，显示高剂量甲醛染毒可降低大鼠脑组织SOD活力。实验证实，经腹腔染毒高剂量甲醛可引起神经细胞的脂质过氧化损伤，降低了SOD，使机体产生氧化应激状态和脂质过氧化，从而引起组织细胞的损伤和免疫功能的下降[9]，对神经细胞产生毒性作用。
彗星实验又称为单细胞凝胶电泳实验。在通常情况下，DNA 双链以组蛋白为核心形成核小体，组蛋白对DNA 结构起到重要的保护作用。在细胞裂解液的作用下，细胞膜、核膜被破坏，RNA、蛋白质等从细胞中逸出，扩散到裂解液中，只有核DNA仍留在凝胶中原来的位置。在碱性条件下，DNA 双链仍保持双螺旋结构，虽偶有单链断裂，但并不影响DNA双螺旋大分子的连续性。如果细胞未曾受到污染物所致的损伤，经荧光染色后核DNA基本集聚星圆形;如果细胞曾经受到DNA断裂剂的损伤，核DNA所产生的断片在电场力的作用下向阳极移动，经荧光染料染色后，形如彗星(故称为彗星实验)[10]。断裂剂的浓度越高，则核DNA 断片越多，电泳后彗尾(Tail Comet)越长，尾部DNA的含量(Tail DNA %)也就越高。本研究结果也证实了高剂量甲醛组的彗星尾巴明显长于对照组，对脑细胞的DNA造成损伤，与周砚青等研究[10]结果一致。
研究结果表明甲醛可使脑组织SOD 活力下降，造成脑细胞DNA 的断裂，甲醛对大鼠中枢神经系统具有一定的毒性作用，但其作用机制有待于今后进一步研究。
【参考文献】
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