肠内营养对梗阻性黄疸幼鼠肠黏膜Bax、Bcl2蛋白表达的影响及意义

【摘要】  目的 探讨肠内营养对梗阻性黄疸幼鼠肠黏膜中Bax、Bcl2表达的影响及意义。方法 将40只Wistar大鼠随机分为正常对照组、假手术组、梗阻性黄疸(OJ)组、OJ+能全素组，免疫组织化学法检测肠黏膜Bcl2和Bax蛋白的表达。结果 OJ组大鼠肠黏膜Bcl2表达降低，Bax表达升高，Bcl2/Bax比值下降(均P<0.01);OJ+能全素组大鼠Bcl2表达增加(P<0.05)，Bax表达降低(P<0.01)，Bcl2/Bax比值升高(P<0.01)。结论 梗阻性黄疸时肠黏膜细胞凋亡显著增加，应用肠内营养对肠黏膜损伤有保护作用，其机制可能是与上调肠黏膜Bcl2蛋白及下调Bax蛋白有关。

【关键词】  梗阻性黄疸;肠内营养;Bax;Bcl2

Effects of enteral nutrition on Bax and Bcl2 expression in gut mucosa in rats with obstructive jaundice and its significance

　　HU Feng'ai1 ZHANG Fan2 ZHAO Dongmei1 ZHANG Luping1 LIU Yehui1 FU Tingliang2

　　1 Department of Anatomy, Binzhou Medical University，Binzhou 256603;2 Clinical Nutrition Center,

　　Affiliated Hospital of Binzhou Medical University

　　【Abstract】 Objective To study the effects of enteral nutrition on expression of Bax and Bcl2 in gut mucosa in rats with obstructive jaundice.Methods The Wistar rats were randomly divided into normal control group，sham operation group，obstructive jaundice(OJ) group，and obstructive jaundice group with nutrison(OJ+N).The expression of Bax and Bcl2 in intestinal mucosa was tested by immunohistochemical methods.Results The expression of Bcl2 in intestinal mucosa in OJ group decreased，while the expression of Bax increased，and the ratio of Bcl2/Bax decreased (P<0.01,respectively)，the expression of Bcl2 in OJ+N group increased (P<0.05)，while the Bax decreased (P<0.01),and the ratio of Bcl2/Bax increased (P<0.01).Conclusion Intestinal mucosa cell apoptosis increased significantly when obstructive jaundice occurred.Enteral nutrition helps lessen the intestinal mucosa damage caused by obstructive jaundice，with the increase of Bcl2 and the decrease of Bax in intestinal mucosa.

　　【Key words】 obstructive jaundice，enteral nutrition，Bax，Bcl2

　　梗阻性黄疸(obstructive jaundice，OJ)是外科常见的疾病，是由肝内毛细胆管、小胆管、肝胆管、肝总管或胆总管的机械性梗阻所致。小儿梗阻性黄疸见于先天性胆道闭锁、胆管扩张症等疾病[1]。随着梗阻时间的延长，胆管内压力逐渐升高，肝内胆管因胆汁郁积而破裂，胆汁直接或由淋巴液反流入体循环，结果使血中结合胆红素增高，引发多种并发症,甚至导致多器官损害。

　　细胞凋亡是细胞在自身基因调控下进行的一种主动死亡，是机体维持自身稳定的一种基本生理机制。细胞凋亡过程受到一系列相关基因的调节和控制：一类为促凋亡基因，如bax、cfos、p53等;另一类是抗凋亡基因，如bcl2、bclw等[2]。细胞凋亡作为一种细胞死亡的特殊形式，是由机体自主性调控的，它为我们进一步认识梗阻性黄疸所致的肠黏膜损害提供了一个新的研究方向。目前对细胞凋亡在梗阻性黄疸肠黏膜损害中的作用报道甚少。本实验采用免疫组化法检测幼鼠梗阻性黄疸肠黏膜上皮细胞Bax、Bcl2蛋白的表达以及应用肠内营养对其表达的影响，以探讨梗阻性黄疸肠黏膜损伤时细胞凋亡的调控机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物与主要试剂 清洁级雄性Wistar大鼠40只，3～4周龄，体重80～100 g，购自山东大学实验动物中心。Bax、Bcl2免疫组化试剂盒由北京中杉生物技术有限公司提供。能全素由荷兰Nutrisia公司提供。

　　1.2 实验分组及模型建立

　　1.2.1 分组：采用随机数字表法随机分为正常对照组、假手术组(SHAM)、梗阻性黄疸(OJ)组和OJ+能全素组，每组10只。

　　1.2.2 幼鼠OJ模型制作：大鼠术前禁食12 h，禁水4 h。氯胺酮(20 mg/kg)腹腔注射麻醉，消毒后，取上腹正中切口，显露肝十二指肠韧带，于近肝门处游离胆总管用0号丝线双重结扎，关腹。假手术组(SHAM)仅做胆总管游离，但不结扎。OJ组术后2d经采血检查总胆红素和直接胆红素，比正常对照高5倍为模型制作成功的标准。模型制作成功后将大鼠置于室温22～26℃、相对湿度40%～70%、安静、通风的环境中分笼喂养,动物给予普通饲料喂养，实验过程中所有大鼠均予自由饮水。模型制作成功后假手术组和OJ组分别于10 d结束实验。OJ+能全素喂养组术后给予能全素，配制成4.184 kJ/ml，能量610 kJ/(kg·d)，含氮量1.0 g/(kg·d)，OJ后1 d摄入标准量的1/3，第2天摄1/2，第3天起摄入全量。每天计划量分4～6次给予。

　　1.3 观察指标及测定方法

　　1.3.1 肠黏膜形态学分析：大鼠处死后，切取距回盲部5 cm处一段长3 cm的小肠，置10%中性甲醛中固定24 h后，石蜡包埋，切片厚6 μm，苏木精伊红染色。每标本取5张不连续的切片，每张切片顺次取奇数视野用显微观测尺在光镜下测定绒毛高度和黏膜厚度。

　　1.3.2 Bax、Bcl2的免疫组化检测：参照免疫组化试剂盒说明进行。结果判断：细胞质出现棕黄色颗粒为阳性表达细胞，无棕黄色颗粒为阴性表达细胞。每个切片选取细胞分布均匀的5个高倍(×400)视野(向同一方向移动切片，不重复，不重叠)作为观察区，分别计数每个视野中的阴性与阳性细胞数。

　　1.4 统计学处理 计量资料以x±s表示，多组均数比较用单因素方差分析，多个样本均数的两两比较(三个手术组与对照组)用Dunnett法，统计学软件SPSS13.0。

　　2 结果

　　2.1 各组实验鼠存活情况 OJ组实验鼠分别于术后1 d、3 d、7 d各死亡1只。OJ+能全素组实验鼠术后2 d、3 d和5 d各死亡1只。死亡原因为术后胃扩张、肠麻痹、肠粘连。OJ组术后9 d死亡1只，为胆道穿孔所致腹腔感染。大鼠于术后1～2 h恢复活动，胆总管结扎术后第48 h，OJ组和OJ+能全素组均出现黄色尿液，且有加重趋势，并于术后3 d出现皮肤黄染。OJ组大鼠5 d内即出现明显肠管扩张、肠壁变薄等现象，普遍活动减少，食欲较差。

　　2.2 肠黏膜形态学改变 正常对照组和假手术组实验鼠回肠黏膜绒毛结构完整，上皮细胞成高柱状，无间质水肿和中性粒细胞浸润。OJ实验模型的回肠黏膜绒毛间隙增大，黏膜腺体排列稀疏，杯状细胞减少，黏膜萎缩变薄。OJ组大鼠回肠绒毛的高度和黏膜厚度明显低于正常对照组、假手术组、OJ+能全素组。OJ+能全素组与正常对照组和假手术组比较，差异无显著性意义(结果另文报道)。

　　2.3 Bax、Bcl2在肠黏膜上皮的表达 Bax和Bcl2在各实验组均有不同程度的表达(见图1～6)，表达的部位在细胞质，正常对照组和假手术组可见较多Bcl2阳性细胞表达，Bax仅有少量表达。各组大鼠肠黏膜Bcl2、Bax阳性细胞数的百分率比较，经方差分析各组均数间差别有统计学意义(F=13.46,P<0.01)。进一步两两比较，假手术组和OJ+能全素组与正常对照组均没有差别，OJ组Bcl2、Bax阳性细胞数高于正常对照组(P<0.01);OJ+能全素组高于OJ组(P<0.05)，详见表1。表1 各组大鼠回肠黏膜Bcl2、Bax阳性细胞数的百分率比较

　　3 讨论

　　本研究观察到幼鼠胆总管结扎后随着胆红素值的逐渐升高，出现明显肠管扩张、肠壁肌层变薄等现象，组织学检查发现胆道梗阻10 d时肠黏膜厚度和绒毛高度明显减低，说明高胆红素可以引起肠黏膜损害;OJ组肠黏膜凋亡细胞增加，说明高胆红素可引起肠黏膜细胞发生凋亡。

　　正常小肠黏膜上皮是一种动态的上皮，每3～8 d更新一次，其本身就存在自发性的凋亡，籍以清除衰老的细胞。其屏障功能的完整性和内环境的稳定主要依赖于肠黏膜细胞凋亡和增殖之间的相互平衡。细胞凋亡是一种细胞在局部环境生理性或病理性刺激下引起的非炎症性死亡，是介于正常与坏死之间的一种病理过程。细胞凋亡与坏死有本质的不同，凋亡是一个有基因表达的主动死亡过程。有研究者[3]将凋亡发生过程分为四个步骤：即诱导凋亡刺激信号的出现、凋亡诱导阶段、凋亡执行阶段和细胞死亡后解体阶段。而Bcl2/Bax基因主要在凋亡执行阶段发挥作用。Bax和Bcl2基因是目前最受关注的与细胞凋亡相关的基因，Bax基因与Bcl2基因同源，二者可形成异二聚体或Bax与自身形成二聚体，通过转基因动物和基因转染实验研究发现，Bcl2对细胞凋亡具有明显的抑制作用，而Bax拮抗Bcl2，促进细胞凋亡[4]。因此Bcl2与Bax的比例决定着细胞受凋亡因素刺激后的生存与凋亡[5]。本研究免疫组织化学检测OJ组大鼠肠黏膜上皮细胞Bcl2表达降低，Bax表达升高，Bcl2/Bax比值下降，肠黏膜细胞凋亡增加。毛晓光等[6]研究发现OJ时肠黏膜上皮细胞内膜结构紊乱，上皮细胞坏死，膜溶解，部分上皮细胞核固缩呈凋亡状态，线粒体空泡变性及内质网扩张。OJ时可发生末段回肠黏膜超微结构的明显异常，凋亡现象增多[7，8]。与本实验研究结果一致。梗阻性黄疸肠黏膜损伤发生细胞凋亡的可能机制为：①氧自由基致损伤：胆道梗阻后肠黏膜上皮氧自由基增多，氧自由基能够导致DNA、蛋白质、脂膜的氧化损伤，从而导致细胞凋亡。氧自由基增多的原因：一是肠黏膜有效血流量明显减少，缺氧导致线粒体呼吸链电子传递障碍，结果产生大量氧自由基;二是自由基清除酶系在体内合成减少，自由基清除能力下降;三是胆盐阻碍线粒体呼吸链的电子传递，增加电子外泄率，促进氧自由基的形成。②炎性细胞浸润：胆道梗阻后，由于肠道胆盐缺乏，清除内毒素的能力下降，大量内毒素吸收入血，形成肠源性内毒素血症，内毒素具有刺激单核细胞产生TNFα等的作用。TNF可能通过激活细胞Ca2+Mg2+依赖的限制性核酸内切酶，导致基因组DNA分子降解为寡聚核苷酸片段，引发细胞凋亡。③OJ所导致的肠黏膜屏障功能不全时，细菌菌群移位促进肠黏膜细胞凋亡。

　　随着肠黏膜屏障功能与细菌移位学说的提出，肠内营养的重视程度日渐提高[9]。据证实，肠道黏膜营养物质的70%直接来源于肠腔内营养物，仅30%来自动脉血液供应[10]。肠内营养循生理途径给予营养物质，营养素经门静脉入肝脏，有利于蛋白质合成，而且通过肠黏膜与营养素的接触，直接向肠黏膜提供其代谢所需要的营养物质，能促进肠黏膜上皮的增生，维持肠黏膜的结构和功能，促进消化液的分泌，改善肠黏膜和肝脏的血液供应，防止肠黏膜酸毒和通透性增加，维持分泌型免疫球蛋白SIgA的产生，使得肠腔细菌能有效包被，内毒素能有效清除。肠内营养能促进肠道运动功能的恢复，促进肠黏膜一氧化氮的释放，降低内毒素血症和菌群移位的发生。能全素是整蛋白型肠内营养制剂，生物利用度高。本研究结果显示OJ+能全素组比OJ组肠黏膜的厚度和绒毛高度显著增加，与假手术组以及正常对照组比较，差异无统计学意义。支持OJ幼鼠给予肠内营养能有效的维持肠黏膜的完整性。OJ+能全素组可见较多Bcl2阳性细胞表达，而Bax阳性表达细胞散在分布，Bcl2/Bax阳性细胞比值显著升高，肠黏膜细胞凋亡受到抑制。肠内营养可增强小肠黏膜细胞Bcl2的表达，说明Bcl2参与肠内营养抑制肠黏膜细胞凋亡的保护机制，这可能是肠内营养减轻梗阻性黄疸肠黏膜损伤的机制之一。

【参考文献】
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　　[9].王浩,吴国豪,周昭彦,等.不同营养方式对肠道缺血再灌注大鼠肠屏障功能影响的实验研究[J].肠外与肠内营养,2004,11(1):3135.

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