曲格列酮诱导胃癌SGC7901细胞凋亡的研究

【摘要】  目的 观察过氧化物酶体增殖激活受体γ(PPAR γ)的配体曲格列酮(troglitazone，TGZ)对胃癌SGC7901细胞凋亡的影响。方法 体外培养人胃癌SGC7901细胞，SGC7901细胞分为对照组和曲格列酮不同浓度(5、10、15、20 μmol/L)加药组，应用流式细胞仪检测曲格列酮不同浓度对胃癌SGC7901细胞凋亡率的影响;RTPCR及Western blot方法观察PPARγ、p53的mRNA及蛋白表达变化。结果 曲格列酮可诱导胃癌SGC7901细胞凋亡，凋亡率与浓度呈正相关;曲格列酮干预后，p53的mRNA及蛋白在胃癌SGC7901细胞中表达上调，而PPARγ的mRNA及蛋白表达水平无明显改变。结论 曲格列酮依赖激活PPARγ能在体外诱导胃癌细胞凋亡，其机制可能是通过上调抑癌基因p53表达而实现，提示PPARγ可能是胃癌治疗的一个新分子靶点。

【关键词】  曲格列酮;过氧化物酶体增殖激活受体γ;p53;胃癌;凋亡

Effects of troglitazone on induction of apoptosis in human gastric adenocarcinoma cell line SGC7901

　　YU Yuan1 WANG Juan2 YANG Jian3 XIE Shuyang1 JIAO Fei1

　　1 Department of Biochemistry and Molecular Biology, Binzhou Medical University,Yantai 264003

　　2 Department of Cell Engineering,Binzhou Medical University;3 Central Blood Station of Yantai

　　【Abstract】 Objective To investigate the effect of peroxisome proliferator activated receptor gamma (PPARγ) ligand troglitazone (TGZ) on induction of apoptosis in human gastric adenocarcinoma cell line SGC7901.Methods Human gastric adenocarcinoma cell line SGC7901 was cultured in vitro. SGC7901 cell line was divided into control group and treatment groups with different concentrations of TGZ (5,10,15,20 μmol/L).The changes of apoptosis at each concentration in the SGC7901 were detected by flow cytometry method. The mRNA and protein expression of PPARγ and p53 were investigated by RTPCR and Western blot respectively.Results The effect of troglitazone on the induction of apoptosis in SGC7901 cells was significant with flow cytometry detection. Furthermore, the rate of apoptosis in SGC7901 cells treated with troglitazone at various concentrations showed a dosedependent manner. After treated with troglitazone,the mRNA and protein expression of p53 was upregulated. However, the expression of PPARγ has no significant changes.Conclusion These results indicate that the apoptosis effect of troglitazone is mediated through PPARγ signaling pathway in gastric adenocarcinoma cell in vitro.The mechanism is probably associated with upregulating of the anticancer gene p53.It's suggested that PPARγ might be a novel therapeutic target for gastric adenocarcinoma.

　　【Key words】 troglitazone,peroxisome proliferator activated receptor gamma,p53,gastric adenocarcinoma,apoptosis

　　肿瘤的发生是一个多因素、多步骤的复杂过程，涉及一系列遗传学改变，包括癌基因的激活和抑癌基因的失活。胃癌是我国最常见的消化道肿瘤，其发生、发展亦涉及多个基因的相互作用，如RAS基因家族、MYC基因家族、p53、RB等[1,2]。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)属于核激素受体超家族中的成员，是一类由配体激活的核转录因子。近年来许多研究表明PPARγ及其配体在人类多种肿瘤细胞的增殖、分化及凋亡中具有调节作用[3]，曲格列酮(TGZ)是其合成配体中药效最强的一种药物，且其毒副作用相对较小[4]。p53是人类肿瘤中最常见的突变基因。p53基因的突变或失活与多种肿瘤的发生、发展密切相关，几乎在所有恶性肿瘤中都存在P53蛋白表达上调的现象[5]。为了探讨人类胃癌细胞中PPARγ经其特异性配体激活后，能否促进胃癌细胞凋亡及其可能涉及机制，本实验利用人胃癌SGC7901细胞进行体外研究，以期寻找一条新的胃癌治疗途径。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 药品与试剂：细胞培养基RPMI 1640购自美国GIBCO公司，胎牛血清为杭州四季青公司生产。曲格列酮为生物晶美公司产品。药物实验前TGZ溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，用无血清培养基稀释至200 μmol/L原液，-20℃冻存，使用时用细胞培养液稀释至终浓度。TRIZOL试剂购自Invitrogen公司，RTPCR试剂盒购自大连宝生物公司，流式细胞试剂购自Beckman公司，PPARγ及p53小鼠抗人单克隆抗体购自生物晶美公司。

　　1.1.2 细胞培养：人胃癌SGC7901细胞株购自于中科院上海细胞库，培养基为含10%胎牛血清的RPMI 1640(100 U/ml青霉素、100 μg/ml庆大霉素)，在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。

　　1.1.3 实验分组：将SGC7901对数生长期细胞悬液调整为4×105/ml接种，培养24 h后，随机分为5组：对照组(细胞+培养液)和加药组(5、10、15、20 μmol/L组)。对照组和加药组均按48 h培养。

　　1.2 方法

　　1.2.1 流式细胞仪检测凋亡率：收集培养48 h后的对照组和加药组细胞，用75%冰乙醇固定，调整细胞浓度为5×107/ml，分别取100 μl的细胞悬液于流式管中，每管加入4.5 μl AnnexinFITC冰上放置避光10 min，再加入2.5 μl PI，避光反应5 min，在488 nm波长处进行检测，记录激发波长493nm处的红色荧光，上流式细胞仪(EpicsXLⅡ型Beckman Coulter)进行检测。

　　按TRIZOL试剂说明书提取细胞中的总RNA，测定RNA的浓度及纯度。取总RNA 2 μl，按RT试剂盒说明进行逆转录，随后取RT产物1 μl进行PCR扩增。PPARγ、p53及内参βactin引物序列及产物长度参见表1。PCR反应条件为：25 μl体系95℃预变性5 min;95 ℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环;最后72℃充分延伸10 min。表1 RTPCR引物序列及产物长度

　　1.2.4 Western blot检测PPARγ、p53的蛋白表达变化：将对数生长期的SGC7901细胞消化，吹打成单细胞悬液，计数，调整细胞终浓度为2×108/L，置于100 ml培养瓶中，每瓶10 ml，待细胞贴壁生长后，弃上清，按照上述实验分组，加药作用48 h后收集细胞，提取总蛋白，蛋白定量后进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)，转膜后加入含小鼠抗人PPARγ、p53单克隆抗体(1∶500稀释)的一抗封闭液，置摇床上30 min，4℃过夜，次日漂洗封闭后加入同位素标记兔抗鼠IgG(1∶2 000稀释)的封闭液，置摇床上晃动2 h后漂洗，经放射自显影后观察蛋白表达的改变。

　　1.2.5 统计学处理：应用SPSS11.0软件进行统计处理，数据用x±s表示，采用方差分析和Dunnett检验进行比较，P<0.05为差异具有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 流式细胞仪检测曲格列酮对SGC7901细胞凋亡的影响 SGC7901细胞经5、10、15、20 μmol/L曲格列酮作用后，随着剂量的增加，与对照相比，凋亡细胞逐渐增加，凋亡率分别为9.3%、12.3%、21.5%和23.7%，与对照相比差异均有显著性(P<0.05，图1及表2)。表2 TGZ对SGC7901细胞凋亡的影响组别 凋亡率# 与5 μmoI/L TGZ组比较差异有统计学意义(P<0.05)

　　2.2 RTPCR 检测曲格列酮对SGC7901细胞PPARγ及p53基因mRNA表达的影响 曲格列酮诱导SGC7901细胞凋亡时PPARγ及p53基因mRNA变化经RTPCR检测显示，SGC7901细胞中PPARγ的mRNA表达与曲格列酮的作用浓度无关，而p53的mRNA表达随着曲格列酮作用浓度的增加而升高(图2)。

　　2.3 Western blot检测曲格列酮对SGC7901细胞PPARγ及p53基因蛋白表达的影响 曲格列酮诱导SGC7901细胞凋亡时PPARγ及p53基因蛋白变化经Western blot检测显示，SGC7901细胞中PPARγ的蛋白表达与曲格列酮的作用浓度无关，而p53的蛋白水平随着曲格列酮作用浓度的增加而升高(图3)。

　　3 讨论

　　胃癌是我国最常见的消化系肿瘤，其发病机制尚未阐明。由于胃癌在早期即可发生转移，对放疗敏感性差，生存率低，因此不断探索高效、高选择性、低毒性的治疗方法仍具有重要意义[6]。为了探讨TGZ对胃癌细胞的作用机制，我们以体外培养SGC7901细胞为研究对象，观察了不同浓度的TGZ对诱导SGC7901细胞凋亡的作用，并检测了细胞凋亡前后抑癌基因p53表达的变化，旨在探讨PPARγ激动剂TGZ诱导SGC7901细胞凋亡的机制，为TGZ辅助治疗胃癌提供实验依据。

　　过氧化物酶体增殖激活受体是一类由配体激活的核转录因子，属于Ⅱ型核受体超家族。迄今为止，共发现了三种PPAR，即PPARα、PPARβ和PPARγ，其中PPARγ及其激动剂是目前研究最多、最广泛的受体[7]。TGZ是一种人工合成的PPARγ激动剂，含有一个噻唑烷二酮环的化学基团，能够和PPAR紧密结合并激活PPAR，随后被激活的PPAR通过打开或关闭特定的基因来调控基因的表达。大量资料证明，PPARγ激动剂对多种肿瘤具有明显的体外抗肿瘤作用[8,9]。PPARγ生物学功能复杂，近年来研究显示，PPARγ在多种肿瘤组织中均有表达，且其被特异性配体激活后，可诱导肿瘤细胞分化，抑制包括结肠癌、胃癌、肺癌、食管癌等恶性肿瘤细胞的增殖或诱导肿瘤细胞凋亡[10，11]。细胞凋亡是一种程序性细胞死亡过程，也是清除非机体所需细胞、维持自身细胞数稳定的一种特殊的细胞死亡方式，而细胞凋亡机制异常在肿瘤的发病中具有重要作用[12]。

　　本实验观察发现，不同浓度曲格列酮干预SGC7901细胞后能明显诱导其凋亡，与正常对照组相比，各组间差异有统计学意义，而且凋亡的诱导程度呈现剂量依赖趋势。大量研究证实，p53可通过多种机制促进细胞凋亡，主要涉及下调抗凋亡蛋白的表达而上调促凋亡蛋白的表达两种途径[13]。本文中不同浓度曲格列酮可逐渐上调p53基因mRNA和蛋白的表达，这提示曲格列酮干预后能诱导SGC7901细胞凋亡可能与其调节细胞内p53的表达水平有关，而凋亡过程中下游信号分子的改变尚有待进一步研究。另外，本文结果显示，PPARγ的表达水平在处理前后并无明显变化，这提示PPARγ除了可以在含量方面进行调节外，还可以在其它层面进行调节[14]。例如，有研究显示PPARγ的活性及细胞内定位可以影响其作用的发挥[15]。

　　总之，本实验表明TGZ作为PPARγ的高亲和力配体，可能通过上调p53表达诱导凋亡，进而抑制胃癌细胞的生长。PPARγ激动剂的抗肿瘤效应可能为未来胃癌治疗提供一个新途径。这一初步结论还需要体内实验进行验证，并从基因和蛋白水平对其具体机制进行深入探讨。

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