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Home医源资料库在线期刊中国热带医学杂志2005年第5卷第2期

敌敌畏抗性淡色库蚊酯酶B1、A2探针制备及应用

来源:中国热带医学杂志
摘要:摘要:目的制备敌敌畏抗性品系淡色库蚊酯酶B1、A2探针,并应用于抗性品系及敏感品系的检测。方法分别设计酯酶B1、A2上下游引物,5’端地高辛标记,PCR法制备DNA探针,分子杂交检测各个品系淡色库蚊。结果摸索出合适的区分抗性与敏感品系的探针浓度,在该浓度下各品系杂交点的阳性率有差别。应用酯酶B1探针检测各品系......

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   摘要:目的  制备敌敌畏抗性品系淡色库蚊酯酶B1、A2探针,并应用于抗性品系及敏感品系的检测。  方法  分别设计酯酶B1、A2上下游引物,5’端地高辛标记,PCR法制备DNA探针,分子杂交检测各个品系淡色库蚊。  结果  摸索出合适的区分抗性与敏感品系的探针浓度,在该浓度下各品系杂交点的阳性率有差别。应用酯酶B1探针检测各品系蚊虫,抗敌敌畏品系的阳性率为40.0%,抗残杀威品系的阳性率为23.3%,抗氯氰菊酯品系的阳性率为183%, 敏感品系的阳性率为117%;应用酯酶A2探针检测各品系蚊虫,抗敌敌畏品系的阳性率为433%,抗残杀威品系的阳性率为250%,抗氯氰菊酯品系的阳性率为217%, 敏感品系的阳性率为150%。  结论  应用酯酶B1、A2探针能够区分抗性品系,因此能够用于抗性的测定。从而为抗有机磷类杀虫剂媒介昆虫基因检测的实用性和抗性分子生物学机制的研究打下基础。

    关键词:淡色库蚊;敌敌畏; 酯酶B1、A2;DNA探针

    中图分类号:R3841    文献识别码:A    文章编号:1009-9727(2005)02-193-03

    Preparation and application of esterase B1 and A2 probe for detection of the resistance of antiDDVP Culex pipiens pallens  CUI Wei1, ZHEN Tian-min1, WANG Huai-wei1, et al  (1Shandong Provincial Institute of Parasitic Diseases, Jining 272033, Shandong, P R China; 2Inistitute of Basic Medicine,Shandong Academy of Medical SciencesJinan 250062,Shandong,PRChina)

    Abstract:Objective  To prepare the esterase B1、A2 probe of DDVP resistant Culex pipiens pallens and detect resistant level of Culex pipiens pallens  Methods  ForwardPrimer and ReversePrimer of esterase B1、A2,  were designed and labeled with digoxin on 5’ end of ForwardPrimer of esterase B1、A2  DNA probe was prepared by  PCR and used for identification and screening the DDVP resistance of Culex pipiens pallens  Results  The probe concentration suitable for the differentiation of resistant and sensitive strains were ascertained by repeated experiment In this concentration, the positive rate of hybrid were different among all strains It shows that with use of esterase Bl probe the positive rates of the strains resistant to DDVP,proproxur and permethrin were 40%,23% and 183%,respectively,while by use of esterase A2 probe the positive rates of the strains to DDVP,propoxur and permethrin were 43%,25% and 117%,respectively  Conclusion  The different resistant strains can be distinguished with esterase B1 probe and esterase A2 probe, thereby we can apply it to detect every sesistant strains This  provided a practical molecular biological method for gene detection of DDVP resistant vector insects

    Key words:Culex pipiens pallens; DDVP;  Esterase B1、A2; DNA probe

    淡色库蚊是山东省优势蚊种,不仅叮咬人类,而且是丝虫病主要传播媒介。目前化学防治仍然为蚊虫防治的主要方法。但长期以来,大量、广泛地应用化学杀虫剂,使蚊虫抗性迅速增加,且各杀虫剂之间产生交互抗性,限制了其杀虫效果,成为蚊虫防治中的突出问题。近年来研究证实,非特异性酯酶活性增高是蚊虫对有机磷杀虫剂产生抗性的主要机制,非特异性酯酶活性增高是由于酯酶结构基因大量扩增,相应地大量表达酯酶造成的[1]。多年来应用的WHO生物测定法检测抗性存在结果波动性大,重复性差,操作繁琐,需时长,在抗性水平低时难以测出抗性存在等缺点。随着分子生物学技术的发展,对媒介昆虫抗性相关解毒酶的研究也不断深入,在基因水平检测蚊虫的抗药性具有精确、简单、方便,实用等优点,为目前蚊虫抗性检测的重要方向之一。本研究以我国北方重要的丝虫病媒介淡色库蚊为研究对象,采用PCR法制备淡色库蚊敌敌畏抗性株酯酶B1、A2 DNA探针,用于对淡色库蚊各品系进行鉴定、筛选,同时以生物测定法检测结果为对照[2],以评价本探针用于蚊虫抗药性基因检测的效果。

    1  材料和方法

    11  材料

    111  蚊虫  淡色库蚊敌敌畏抗性品系(Rd)、残杀威抗性品系(Rp)和氯氰菊酯抗性品系(Rc)为本所养蚊室抗性筛选品系,敏感品系(S)为本所养蚊室常规饲养。

    112  主要化学试剂  无水乙醇,氯仿,异戊醇,醋酸钠,均为国产分析纯。蛋白酶K,饱和酚, 琼脂糖,Maeker, PCR试剂盒,均购自Sangon公司,尼纶膜为Amersham公司产品,酯酶B1、A2引物由博亚公司合成,酯酶B1、A2上游引物5’端地高辛为博亚公司标记。地高辛抗体为罗氏公司产品,NBT/BCIP,购自华美生物工程公司。

    12  方法

    121  淡色库蚊基因组DNA的提取[3]  用吸蚊管取羽化后24~48h的成蚊200只,-70℃冷冻1h后研磨成碎末,加匀浆缓冲液研磨5min,4℃离心10min弃上清,37℃蛋白酶K消化3h,酚:氯仿:异戊醇各抽提两次,乙醇醋酸钠沉淀过夜,超纯水溶解,冷冻保存。单蚊DNA提取方法同前。

    122  PCR扩增酯酶B1和A2目的片段[4]  设计酯酶B1和A2引物,根据Gene Bank分别从尖音库蚊酯酶B1基因和致倦库蚊A2基因[5]的一段外显子中各设计一对引物,由上海博亚生物公司合成。其中,上海博亚生物公司在酯酶B1和A2上游引物5’端标记地高辛。其序列为:

    酯酶B1  Forward-Primer  ATTCTCCCGAGCTGGGACTA

            Reverse-Primer  AACTTCCTGCTCACGAACGA

    酯酶A2  Forward-Primer  CCTTTCGCGGGGATTGTTTCA 
 
            Reverse-Primer  ATCTGCTTGCCCACCTCTTTG

    PCR反应体系试剂用量见表1。

    表1  PCR反应体系                          (略)
  
    Table1  PCR reaction system

    总体积为50ul,混匀,加入40uL液体石蜡油覆盖,短暂离心。上述反应管94℃预变性5min,在PE-480PCR扩增仪上做30次循环反应:94℃变性1min,55℃退火1min,72℃延伸1min,最后,72℃终止延伸10min。-20℃保存备用。低熔点凝胶经酚氯仿抽提法回收酯酶B1和A2探针,紫外分光光度计测算出探针浓度,-20℃保存。

    123  地高辛杂交及显色[6]  ①基因组DNA变性:将蚊虫基因组DNA沸水浴5min后,立即冰浴10min。②点膜:采用手工点膜,80℃热固定。③地高辛杂交;探针热变性5min,冰浴10min,加入杂交液中。膜置入塑料袋中,加入杂交液和探针。赶走气泡,封口。在42℃水浴中杂交16min。④洗膜:用洗脱液洗膜后加入封闭液封闭30min,加入地高辛抗体反应30min,洗脱液洗膜。⑤显色:在1×稀释液中平衡2min,加入NBT/BCIP,混匀,避光显色30min。

    2  结果

    21  酯酶B1和A2目的片段的扩增  结果如图1 ,经过PCR反应,可以看到目的条带十分清晰明亮,其中酯酶B1条带大小约450bp左右,酯酶A2条带大小约557bp左右,与预期扩增结果完全一致。

    图1  酯酶A2、B1的PCR电泳图谱             (略)

    图2、3  杂交敏感性试验结果               (略)

    (2、3为抗敌敌畏品系DNA杂交结果)

    22  抗性检测

    221  应用酯酶B1探针及生物测定法检测各品系蚊虫抗性  每个品系淡色库蚊取60个单蚊DNA,稀释其至1/150, 取05ul点样。 杂交结果显示,抗敌敌畏品系的阳性率为400%,抗残杀威品系的阳性率为233%,抗氯氰菊酯品系的阳性率为183%,敏感品系的阳性率为117%。可以看出抗敌敌畏品系阳性率最高,抗残杀威品系次之。抗氯氰菊酯阳性率高于敏感品系,但是低于残杀威品系。与生物测定法的检测结果相一致(表2)。其中酯酶B1探针检测敌敌畏抗性品系单蚊DNA,出现24个阳性点;检测敏感品系蚊虫单蚊DNA,出现7个阳性点(图4、5)。

    表2  淡色库蚊酯酶B1探针及生物测定法抗性检测的结果           (略)

    Table 2  The detection results of DDVP resistant strain with esterase B1 probe and compared with bioassay

    图4、5  淡色库蚊酯酶B1探针抗性检测结果                      (略)

    (左下角两个杂交点为阳性对照)

    4 敌敌畏品系检测结果  5 敏感品系检测结果

    4 Detection result of DDVP strain with esteraseB1 probe

    5 Detection result of sensitive  strain with esteraseB1 probe

    222  应用酯酶A2探针及生物测定法检测各品系蚊虫抗性  每个品系淡色库蚊取60个单蚊DNA, 稀释其至1/20, 取05ul点样。杂交结果显示,抗敌敌畏品系的阳性率为433%,抗残杀威品系的阳性率为250%,抗氯氰菊酯品系的阳性率为217%,敏感品系的阳性率为150%。因此抗敌敌畏品系阳性率最高,残杀威品系阳性率高于氯氰菊酯品系,敏感品系阳性率最低。与生物测定法的检测结果相一致(表3)。其中酯酶A2探针检测敌敌畏抗性品系单蚊DNA,出现26个阳性点;检测敏感品系单蚊DNA,出现9个阳性点(图6、7)。

    表3  淡色库蚊酯酶A2探针及生物测定法抗性检测的结果           (略)

    Table 3  The detection results of DDVP resistant strain with esterase A2 probe and comparwith bioassay

    图6、7  淡色库蚊酯酶A2探针抗性检测结果                      (略)

    (左下角两个杂交点为阳性对照)

    6 敌敌畏品系检测结果  7 敏感品系检测结果

    6 Detection result of DDVP strain with esteraseA2 probe

    7  Detection result of sensitive  strain with esteraseA2 probe

    3  讨论
 
    媒介昆虫抗性相关解毒酶的基因扩增和调节是抗性的重要机理。其中,库蚊对有机磷杀虫剂产生抗性的主要机理是酯酶基因扩增导致解毒酶过度产生,高活性的酯酶通过结合或水解有机磷而起解毒作用。库蚊抗性相关酯酶基因分为A组和B组,两组酯酶都存在扩增。到目前为止,至少已发现十余种高活性酯酶,分别从A1到A9,从B1到B9。其中,A3和B3出现在美国的跗斑库蚊中(Ctarsalis),其他种类酯酶出现在尖音库蚊复合组如淡色库蚊和致倦库蚊中。1997年,Guillemaud应用点杂交检测Tem-R的酯酶B1基因拷贝大约是敏感品系的20倍[7]。Karunaratne和Hemingway认为来自不同地区的同种酯酶是各自独立扩增的结果[8]。Raymond等认为高活性酯酶基因在某一地方扩增后,再传播到世界各地,而后在各地增加其扩增倍数[9]。1999年,王金福发现不同的有机磷杀虫剂对酯酶等位基因具有明显的选择作用。双硫磷品系为B1型,毒死蜱和敌百虫品系为B2型,马拉硫磷品系为B1型和B1/B2杂合型[10]。所以不同地区库蚊的酯酶基因扩增类型可能不同,同一地点库蚊的酯酶基因扩增类型可能也不会相同。因此本研究同时采用酯酶B1和A2片段作为探针,可以保证检测结果的全面性,防止漏检的发生。

  酯酶基因结构分析表明,扩增的酯酶基因是以“扩增子”(amplicom)形式存在的,即在酯酶编码序列两侧有共同扩增片段[9,11,12]。各种酯酶基因间尽管有同源性,但其限制片段各不相同。Raymond等比较了编码酯酶B1和B2的BamHI-HindⅢDNA片段,发现有96%的核苷酸序列是同源的,所编码的氨基酸序列由于密码子简并性,同源性为97%。因此酯酶B1探针不仅可以和被检测蚊虫的高活性酯酶B1杂交上,也可以和各品系蚊虫B组的其他类型酯酶杂交上,即酯酶B1探针也可以和酯酶B2、B3、B4、B5、B6……杂交上;酯酶A2探针同理。总之,酯酶B1和A2探针的制备和应用是对各品系淡色库蚊群体内总体抗性的检测,而不是对蚊虫体内某一个酯酶扩增的检测。通过本探针检测结果可以看到,酯酶B1探针在稀释到1/150杂交点出现差异,稀释到1/500时未见明显杂交点;而酯酶A2探针在稀释到1/20出现差异,稀释到1/50时未见明显杂交点。因此,可以考虑在被检测蚊虫体内总体酯酶B组基因扩增水平明显高于酯酶A组酯酶基因扩增水平。其中,抗敌敌畏品系阳性率最高,抗残杀威品系次之。抗氯氰菊酯阳性率高于敏感品系,但是低于残杀威品系。检测结果与生物测定法相一致。DNA探针检测方法与生物测定法相比具有灵敏度高,特异性强,简便实用等特点。应用该方法检测抗性可以及时掌握蚊虫抗药性的现状,研究其发生发展规律及治理对策,进而为科学合理地进行化学防治提供依据。此研究方法为抗有机磷类杀虫剂媒介昆虫基因检测应用于现场和抗性分子生物学机制的研究打下了基础。

    参考文献:

    [1] Mouches, C Pasteur, N Berge, JB and Georghiou, GP Amplification of an esterase gene is responsible for insecticideresistance in a California Culex mosquito[J] Science, 1986; 233(4765): 778~780

    [2] 唐振华昆虫抗药性及其治理[M]北京: 农业出版社,1993

    [3] 林万民.医学分子微生物学进展[M].第二集.北京: 人民军医出版社,1993

    [4] 梁国栋 最新分子生物学实验技术[M]  北京: 科技出版社 2001

    [5] 乔传令,Hemingway, J 李,等有机磷抗性致倦库蚊种群中酯酶基因扩增的定量分析[J]昆虫学报, 2003, 46 (1): 11~13

    [6] J 萨姆布鲁克 DW 拉塞尔 著 黄培堂等译分子克隆实验指南[M] 北京: 科学技术出社.2003

    [7]  Guillemaud, T, Makate,N, Raymond, M, Hirst, B and Callaghan, A (1997) Esterase gene amplification in Culex pipiens[J] Insect Mol Biol 6, 319~327

    [8] Karunaratne, H P P, Hemingway, J Characterization of a B-type esterase involved in insecticide resistance from the mosquito Culex quinquefasciatus  Biochem[J] Soc Transactions 1993, 21: 480s

    [9] Raymond,  M Callaghan, A Fort, P and Pasteur N  Worldwide migration of amplified insecticide resistance genes in mosquitoes[J] Nature, 1991; 359(6314):151~153

    [10]  王金福,陈睿,陆绍红,等淡色库蚊等位基因及其在自然种群中的频率分布[J]昆虫学报,1999, 42(3):257~263

    [11] Poirie, M Raymond, M and N Pasteur  Identification of two distinct amplifications of the esterase B locus in Culex pipiens (L) mosquitoes from Mediterranean countries[J]  Biochem Genet,1992; 30(1/2): 13~26

    [12] Mouches, C  Pauplin, Y Agarwal, M Lemieux, L and Pasteur, N  Characterization of amplification core and esterase B1 gene responsible for insecticide resistance in Culex[J] Proc Natl Acad Sei USA, 1990;87(7):2574~2578

作者单位: 1山东省寄生虫病防治研究所,山东 济宁  272033;  2 山东省医学科学院基础医学研究所,山东 济南  250062

    作者简介: 崔伟(1973~), 男, 汉族, 河北省邯郸人, 在读硕士研究生, 主要从事分子与免疫寄生虫研究


 

作者: 崔伟 甄天民 王怀位 程鹏 徐晓群 谭文彬 孙传红
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