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Home医源资料库在线期刊中国热带医学杂志2005年第5卷第3期

流式细胞术检测Th1/Th2在再生障碍性贫血中的临床意义

来源:中国热带医学杂志
摘要:摘要:目的通过流式细胞术检测再生障碍性贫血患者中Th1、Th2细胞的数量,进一步探讨其在再生障碍性贫血发病机制中的作用及临床意义。方法用流式细胞术检测23例再生障碍性贫血患者及20例正常对照者外周抗凝血CD4+T淋巴细胞IFN-γ、IL-4的分泌,分别反映Th1、Th2细胞的数量。结果再生障碍性贫血患者Th1样细胞因子IFN......

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  摘要:目的 通过流式细胞术检测再生障碍性贫血患者中Th1、Th2细胞的数量,进一步探讨其在再生障碍性贫血发病机制中的作用及临床意义。 方法 用流式细胞术检测23例再生障碍性贫血患者及20例正常对照者外周抗凝血CD4 + T淋巴细胞IFN-γ、IL-4的分泌,分别反映Th1、Th2细胞的数量。 结果 再生障碍性贫血患者Th1样细胞因子IFN-γ的水平较正常对照组明显升高(P<0.01),Th2样因子IL-4与正常对照组比较差异无明显性(P>0.05)。 结论 再生障碍性贫血中Th1水平明显增多,Th2水平却大致正常,提示Th1/Th2比例失衡可能是导致再障造血衰竭的重要因素,是再障发病机制之一。   

  关键词:再生障碍性贫血;Th1/Th2;流式细胞术

  Clinical significance of determination of Th1/Th2in aplastic anemia by using flow ctrometry.GAO Shen,HOU Zhi-fu,ZHENG De-ming.(Department of Central Laboratory of Sino-Japan Friendship Hospital,Jilin University,Jilin130033,Jilin,P.R.Chian)   

  Abstract:Objective To evaluate the effect of Th1/Th2on aplastic anemia by FCM and investigate the role of Th1/Th2in pathogenesis of aplastic anemia. Methods The level of Th1/Th2of CD4 + T lymphocytes cells in peripheral blood of23cases with aplastic anemia and20cases as healthy control were measured by FCM. Results The level of IFN-γin23cases of aplastic ane-mia were significantly higher than those in the group control(P<0.01),while the level of IL-4has no change(P>0.05). Conclusion The results suggest that the level of Th1increases and the level of Th2is nearly normal.Disbalance of Th1/Th2leads to the hematopoietic failure and it is one of pathogenesis of aplastic anemia.   

  Key words:Aplastic anemia;Th1/Th2;Flow cytometry      

  再生障碍性贫血是由多种病因引起的造血障碍,其发病机制至今尚未阐明。大量研究表明机体免疫调节机制紊乱在再障发病中起重要作用 [1] 。Th1和Th2的平衡失调与各种免疫相关性疾病的关系是目前研究热点 [2] 。IFN-γ和IL-4分别是Th1和Th2的代表性细胞因子,我们应用流式细胞术对再障患者外周血Th1/Th2的表达进行检测,并分析其在再障发病机制中的作用及临床意义。

  1 材料与方法   

  1.1 检测对象 23例再障患者,均符合全国再障诊断标准 [3] ,男性11例,女性12例,中位年龄28岁(5~71岁)。对照组20例,为正常志愿献血者,其中男性12例,女性8例,中位年龄26岁(18~46岁)。   

  1.2 仪器与试剂 流式细胞仪(美国Beckman-Coulter公司生产的EPICS ELITE型)。主要试剂FITC标记的鼠抗人CD4单克隆抗体,PE标记的鼠抗人IFN-γ单克隆抗体,PE标记的鼠抗人IL-4单克隆抗体,FITC标记的鼠抗人同型阴性对照IgGl和PE标记的鼠抗人同型阴性对照IgGl,均购自美国eBioscience公司,佛波酯(PMA),离子霉素(ionomycin)和莫能霉素(mon-ensinm)购自Sigma公司,破膜剂和固定剂(IntraPrepA、In-traPrepB)购自法国Immunotech公司。   

  1.3 方法 取EDTA抗凝的再生障碍性贫血患者外周静脉血2ml,用淋巴细胞分离液分离单个核细胞,调整细胞浓度为1×10 6 个/ml,取100μl单细胞悬液分别加入两只试管作为阴性对照(A管)和测定管(B管),再分别加入100μl RPMl1640,在A管中加入3.4μl1mg/ml Monensin工作液,在B管中加入5μl1μg/ml PMA工作液、4μl50μg/ml lonomycin工作液、3.4μl1mg/ml Mo-nensin工作液,混匀后放入37℃5%CO 2 培养箱培养4h,混匀后取100μl,加入CD4-FITC适量,室温避光孵育15min,用PB-Sl500转/分离心5min,弃上清,混匀后加入100μl的IntraPrepA室温固定15min,用PBS洗后加入100μl的IntraPrep B破膜5min,两管分别加入IFN-γ-PE、IL-4-PE适量,室温避光孵育15min,PBS洗后加入0.8ml PBS,上机收集10000个细胞进行分析。   

  1.4 数据分析 用Flow-Check标准荧光微球校正仪器光路,调整FITC/PE的荧光补偿,以CD4/IFN-γ、CD4/IL-4分别建立双参数直方图,得出CD4 + /IFN-γ、CD4 + /IL-4的百分率。   

  1.5 统计学方法 实验数据IFN-γ和IL-4用平均值±标准差表示,Th1/Th2以比值表示,统计数据由SPSSl0.0软件进行t检验统计学处理。

  2 结果   

  2.1 再障患者CD4 + T淋巴细胞IFN-γ、IL-4的表达 Th1和Th2的代表性细胞因子分别为IFN-γ和IL-4,通过流式细胞术检测再障患者外周血胞浆中的IFN-γ和IL-4,结果IFN-γ的表达率明显高于对照组(P<0.01),而IL-4的表达率与正常对照组差异无显著性(P>0.05)。(见表1)   

  表1 外周血CD4 + T淋巴细胞IFN-γ、IL-4的表达(%)(略)

  表2 外周血Th1/Th2的比值(略)

  3 讨论   

  再生障碍性贫血的确切发病机制至今并不十分清楚,目前存在3种学说,造血干细胞缺陷、免疫紊乱和骨髓微环境异常,其中以免疫发病机制为当今研究热点。Young提出免疫性再障是一种以骨髓为靶器官的自身免疫性疾病 [4] ,而细胞因子与免疫性疾病密不可分。机体CD4 + T淋巴细胞正常情况下处于前体状态,在不同细胞因子的作用下进一步分化成Th1和Th2 [5] ,前者介导细胞免疫,后者介导体液免疫。正常情况下Th1和Th2彼此相互抑制,处于动态平衡状态,维持机体正常的细胞免疫和体液免疫功能。Th1和Th2之间存在相互制约或促进作用,与其他细胞因子组成一个复杂的分子网络,参与调节免疫反应及器官功能的自我稳定。细胞因子介导的免疫反应在再生障碍性贫血中起着重要作用。细胞因子影响骨髓造血细胞的形成 [6] 。再障患者T淋巴细胞体外培养发现分泌IFN-γ等细胞因子增多 [7] ,高表达的IFN-γ等细胞因子能诱导骨髓CD34 + 细胞Fas的表达增多 [8] ,从而使造血细胞凋亡,抑制骨髓造血功能,使骨髓造血功能衰竭,证实了IFN-γ是造血负调控因子。IL-4是Th2型细胞因子,可使Th1细胞向Th2方向转化,在再障中也应有拮抗Th1细胞的功能,但本研究并未发现此趋势,原因还有待于进一步探讨。   

  细胞因子网络的稳定是维持造血系统内环境稳定的关键因素之一,其平衡失调与再障的免疫学发病机制密切相关。迄今多数报道再障中的细胞因子都是检测血清中的细胞因子,而血清中的细胞因子除来源于免疫细胞外,还来源于基质细胞,不能客观地反映免疫细胞的活化或机体的免疫功能状态。随着流式细胞术的广泛应用和相应细胞因子单克隆抗体的问世,使得检测特定细胞胞浆中的细胞因子成为可能,并且此检测方法更加快速、特异,结果更加准确可靠。本研究根据Th细胞的分泌特征,用细胞因子刺激剂(佛波酯和离子霉素)体外刺激再障患者和正常人外周血单个核细胞,同时用蛋白转运抑制剂 (莫能霉素)抑制细胞内的细胞因子分泌到细胞外,然后标记膜表面抗原,再标记细胞内细胞因子,应用流式细胞仪对再障患者外周血胞浆中的IFN-γ和IL-4进行检测,IFN-γ表达率较对照组明显升高,IL-4与对照组差异无显著性,Th1和Th2比例失调,与文献报道一致 [9] 。再生障碍性贫血是Th1细胞亢进的疾病 [9,10] ,临床应用免疫抑制剂治疗再障也足以证明T淋巴细胞及其所分泌的细胞因子在再障发病机制中起重要作用 [11] 。随着对再障的免疫学发病机制的深入研究,将细胞因子拮抗剂作为再障生物治疗的一条新途径值得探索。

  参考文献:    

  [1]Nakao S.Immune mechanism of aplastic anemia[J].Int J Hematol,1997,66(2):127~134.   

  [2]Romagnami S.T-cell subsets(Th1versus Th2)[J].Ann Allergy AsthmaImmunol,2000,85:9~18.   

  [3]张之南,沈悌.血液病诊断与治疗标准[M].第2版.北京:科学出版社,1998,33~35.   

  [4] Young NS.Hematopoietic cell destruction by immune mechanisms in ac-quired aplastic anemia[J].Semin hematol,2000,37:3~14.   

  [5]Mosmann IR,Sad S.The expanding universe oft cell subsets:Th1,Th2and more[J].Immunol Today,1996,17:138.   

  [6]Maciejewaki JP,Hibbs JR,Anderson S et al.Bone marrow and peripheral blood lymphocyte phenotype in patients with bone marrow failure[J].ExpHematol,1994,22(10):1102~1110.   

  [7]Laver J,Castro Malaspina H,Keman NA,et al.In vitro interferongamma production by cultured T-cells in severe aplastic anaemia:correlation with granulomonopoietic inhibition in patients who respond to antithymocyte glob-ulin[J].Br J Haematol,1988,69:545~550.   

  [8]Killick SB,Cox CV,Marsh JC,et al.Mechanisms of bone marrow progeni-tor cell apoptosis in aplastic anaemia and the effect of anti-thymocyte glob-ulin:examination of the role of the Fas-Fas-L interaction[J].Br JHaematol.2000,111:1164~1169.   

  [9]和虹,邵宗鸿.Th1细胞在再生障碍性贫血发病机制中的作用[J].中华血液学杂志,2002,23:574~577.   

  [10]Kook H,Zeng W,Gubin C,et al.Increased cytotoxic T cells with effec-tor phenotype in aplastic nemia and myelodysplasia[J].Exp Hematol,2001,29:1270~1277.   

  [11]Platani AS,Dhuik K,Sam J,et al.Alteration in lymphocytephenoty andlymphokine in patients with aplastic anemia following antithymocyteglobulin(lPG)therany[J].Blood,1998,66(2):347~351.    

  作者单位:吉林大学中日联谊医院中心实验室,吉林吉林 130033.

作者: 高申侯治富郑德明
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