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摘要:目的 评价胎盘组织荧光PCR（FQ-PCR）在先天梅毒早期诊断中的作用。 方法 对34例梅毒孕妇和30例非梅毒对照孕妇的胎盘和脐带组织进行梅毒螺旋体DNA的荧光定量PCR检测，并与常规临床及血清学综合诊断方法比较。 结果 34例梅毒孕妇的胎盘组织中，11例荧光PCR为阳性，阳性率为32.35%，30例非梅毒孕妇的胎盘和脐带样本荧光PCR均为阴性;以常规临床及血清学综合诊断方法为标准，则荧光PCR与常规方法结果的灵敏度为82%，特异性100%，约登指数0.82。显示在诊断先天梅毒新生儿时，FQ-PCR至少有不低于常规综合诊断方法的价值。 结论 与常规临床血清学综合诊断方法相比，荧光PCR均有明显的优势。
关键词:先天梅毒;FQ-PCR;诊断
Study on detection of placental Treponema pallidum DNA for diagnosis of congenital syphilis by using FQ-PCR.PENG Shi-qian，ZHOU Hua，ZHANG Rong，et al.（Baoan District of Shenzhen Municipal of Chronic Diseases Control and Prevention，Shenzhen518133，Guangdong，P.R.China）
Abstract:Objective To evaluate the role of FQ-PCR in detection of placental Treponema pallidumDNA for diagnosis of con-genital syphilis. Methods Thirty-four placental specimens from pregnant women with syphilis and thirty specimens from health pregnant women were blindly evaluated with:（1）FQ-PCR for placental Treponema pallidumDNA;（2）Traditional comprehensive approach for diagnosis of congenital syphilis.The results were compared with each other. Results Among the34placentas from syphilitic women who completed pregnancy，11had positive FQ-PCR.None of the30infants from health mother had positive result.FQ-PCR for placental Treponema pallidum DNA showed comparable sensitivity superior to the traditional comprehensive approach for diagnosis of congenital syphilis. Conclusion FQ-PCR for placental Treponema pallidum DNA could be an addition to conven-tional diagnostic tools.
Key words:Congenital syphilis;FQ-PCR;Diagnosis
20世纪80年代以来，随着梅毒在我国的再度流行，先天梅毒的发生率迅速增加。先天梅毒可引起多器官严重损害，患儿出生后数周即可出现全身皮疹，心、肺、肝、肾等器官损害，甚或死亡 ［1］ 。但是，先天梅毒早期诊断主要是依靠传统的血清学诊断方法，存在明显不足，无法满足临床需要。因此，敏感和特异的先天梅毒早期诊断方法的探讨成为当今梅毒学研究的重要内容之一。近来，国内进行了一些相关研究，但有关荧光定量PCR（FQ-PCR）技术在先天梅毒诊断中的应用相关报道很少。为此，我们应用FQ-PCR技术对34例梅毒孕妇分娩或引产时的胎盘和脐带组织中的TP-DNA进行了检测，并与目前广泛使用的诊断先天梅毒的临床及血清学综合诊断方法进行比较。
1 材料与方法
1.1 研究对象 2002年7月～2004年12月，由深圳市、区各医院产科转诊到深圳市慢性病防治院或宝安区慢性病防治院的34例梅毒血清学筛查试验阳性，符合中国卫生部颁（2000年）《性病诊疗规范和推荐治疗方案-梅毒诊断标准和治疗规范》中诊断标准，并完成妊娠或选择引产者;另选择30例梅毒血清学筛查试验阴性的同期产妇或引产妇为正常对照。要求所有参加研究者，全部签署知情同意书。
1.2 样本的收集和检测 由专人在严格无菌操作的情况下，取引产的新鲜全层胎盘和脐带，放入无菌的带盖塑料瓶中，-20℃低温保存（保存时间小于3个月）。两组标本采用盲法检测。并在分娩后，立即抽取母亲和新生儿静脉血。
1.3 研究方法 梅毒螺旋体FQ-PCR试剂盒由深圳匹基公司提供生产，Bio—RAD icycler荧光PCR检测仪;RPR试剂上海荣盛生物技术有限公司生产;TPPA试剂由日本富士瑞必欧株式会社（FUJIREBIO INC，TOKYO）生产;FTA-ABS-19S-IgM试剂盒德国欧蒙医学实验室诊断试剂有限公司（EUROMMUN）生产。上述实验都严格按试剂盒说明书操作并判读结果。1.4 先天梅毒诊断标准 参照美国疾病控制中心1988年修订先天梅毒的诊断标准中出现下列情况之一者诊断为先天梅毒 ［2］ :（1）母亲梅毒非螺旋体及螺旋体血清试验阳性，新生儿出现早期先天梅毒的典型临床表现;（2）母亲和新生儿非螺旋体及螺旋体血清学试验阳性，分娩时新生儿非螺旋体血清学试验滴度大于或等于母亲之滴度;（3）分娩时新生儿和母亲的非螺旋体与螺旋体血清学试验均为阳性，新生儿FTA-ABS-19S-IgM阳性;（4）母亲非螺旋体及螺旋体血清学试验阳性，新生儿FTA-ABS-19S-IgM阳性。
2 结果
2.1 一般资料 病例组34例符合纳入标准的梅毒孕妇完成了整个研究过程。其中，29例孕妇接受了正规的驱梅治疗，5例孕妇未治疗或治疗不充分（已行治疗，但疗程不足或未按照标准治疗均为治疗不充分）;对照组30例梅毒血清学检查为阴性的孕妇中，年龄最小21岁，最大30岁，平均年龄24.86岁。均完成妊娠。64名新生儿中，男34例，女30例;胎龄<37周10例，满37周54例;出生体重<2500g19例，>2500g45例。所有新生儿中，仅3例有与先天梅毒一致的临床表现。
2.2 胎盘及组织的FQ-PCR检测 64份标本中，按常规临床血清学先天梅毒诊断标准，诊断9例为先天梅毒，其中确诊1例，拟诊8例。以荧光PCR检测11例为阳性，全部来自病例组。30例非梅毒孕妇的胎盘和脐带样本各项检查均为阴性。
34例梅毒患者FQ-PCR检测结果与常规临床血清学综合诊断方法结果见表1。
表1 34例梅毒患者FQ-PCR与常规检查结果比较（略）
Table1 Comparing results in detection of34syhilis casesby FQ-PCR and conventional methodFQ-PCR
*常规临床血清学诊断方法包括结合临床症状，母/婴RPR滴度和FTA-ABS-19S-IgM。
参照美国疾病控制中心推荐的先天梅毒诊断标准。结果FQ-PCR与常规检查的结果差异无显著性。表明两种方法间有较好的一致性（Kappa值>0.6）。如果以常规临床血清学综合诊断方法为标准，则FQ-PCR与常规检查结果的灵敏度为82%，特异性100%，约登指数0.82。
3 讨论
先天梅毒早期诊断主要的困难在于，确诊必须检查到苍白梅毒螺旋体。但梅毒螺旋体的体外培养的问题始终没有得到解决，尽管兔感染试验（RIT）可以确诊，但费用高昂而且费时极长，无法应用于临床。
近年来，聚合酶链技术得到了长足的发展，引起了相关学者的关注。研究证实，聚合酶链技术可检出0.01pg的纯化抗原，只要各种临床组织或体液中存在 1条梅毒螺旋体既可检出 ［3］ 。Grimprel ［4］ 和Sanchez等 ［5］ 证明PCR检查新生儿血清和脑脊液的结果，与RIT有高度相关性，而且对先天梅毒的诊断可以有74%的敏感性和96%的特异性。但PCR的运用中，样本的来源尚存在争议;Konrad Wicher等以感染梅毒的兔为动物模式验证PCR各种样本的价值，认为全血、新鲜或冷冻组织样本均有理想的结果，而血清不适合进行PCR检查 ［6］ 。Jennifer M等的研究则认为，损伤部位的分泌物，血清，脑脊液，羊水和组织为样本均可用于PCR检测梅毒螺旋体 ［7］ 。尽管存在争议，但PCR在先天梅毒的诊断中具极高的价值已是公认的事实。
常规PCR方法存在较大的缺陷。1996年，由美国Applied Biosystems公司推出的实时荧光定量PCR技术，弥补了常规PCR易产生假阳性和不能定量两大技术缺陷。与竞争性PCR、PCR-EILA等定量PCR相比 ［8］ ，荧光定量PCR除了有快速、操作简便，还不需对PCR产物进行后处理，从而防止了扩增产物污染等优点外，具有定量范围宽、定量准确等优点。理论上，荧光定量PCR可用于先天梅毒的诊断。国内蔡兰、何世全、李建民和段逸群 ［9～12］ 等先后将PCR和荧光定量PCR技术用于其它各型梅毒的诊断，认为良好的特异性使其在梅毒和其它螺旋体病的鉴别诊断、梅毒螺旋体的病原学研究等方面具有重要作用。此外，合并HIV感染的梅毒病人血清学试验常呈阴性，此时用PCR检测脑脊液中是否存在梅毒螺旋体是证实其感染的唯一方法。但是，国内尚未见将荧光定量PCR用于先天梅毒诊断的报道。
为此，本次在研究中采用了荧光定量PCR技术来检出胎盘组织中的梅毒螺旋体的DNA。以探讨荧光定量PCR技术在先天梅毒诊断中的价值。结果与常规血清临床综合综合诊断方法进行比较，通过统计分析显示:P>0.05（McNemar's检验），尚不能认为FQ-PCR与综合诊断方法的结果差异有显著性。显示两种方法间有较好的一致性（Kappa值>0.6）。如果以常规血清临床综合诊断为标准，则FQ-PCR与常规检查结果的灵敏度为82%，特异性100%，约登指数0.82。显示在诊断先天梅毒新生儿时，荧光定量PCR至少有不低于综合常规诊断方法的价值。而优于临床症状，母/婴RPR滴度之比和FTA-ABS-19S-IgM三种常规诊断方法中的任何一种，这对于提高先天梅毒的检出率，减少漏诊的发生，有积极的意义。本研究2例荧光定量PCR检查阳性，而出生时通过常规诊断无法确诊的新生儿，并不能排除先天梅毒诊断，因为有研究证明:即使感染了梅毒螺旋体，宿主亦可表现为血清学试验阴性 ［13］ 。此2病例也应列为先天梅毒危险病例予以正规驱梅治疗，并追踪观察。而且，本试验中，30例梅毒血清学试验阴性孕妇胎盘和脐带组织的荧光定量PCR检查结果均为阴性，显示荧光定量PCR技术也有较好的特异性。
尽管荧光定量PCR技术检测梅毒螺旋体NDA的敏感性高，在试验中仅检测了相对较少的组织，而胎盘和脐带组织中梅毒螺旋体的数量又极少 ［14］ ，因此，也存在遗漏的可能。需要扩大试验，进一步证实其在先天梅毒诊断中的价值。
综上所述，荧光定量PCR技术敏感，特异，操作简便，结果观察明确，试验过程较短，且国内已有商品化试剂盒供应，随着生产批量的增加，可望降低售价，是一种极有前途的早期诊断先天梅毒的实验方法。事实上“欧洲性传播疾病处理指南”中已将PCR结果作为先天梅毒确诊试验。
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作者单位:
1.深圳市宝安区慢性病防治院，广东深圳 518133;
2.深圳市慢性病防治院，广东深圳 518020.