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摘要:目的 了解深圳市宾馆、大型写字楼、地铁等各类建筑物的空调冷却塔水军团菌污染状况。 方法 随机采集中央空调冷却塔水样品并进行细菌培养和鉴定，再以聚合酶链式反应（PCR）等方法加以验证。 结果 共采集水样28件，分离到1株军团菌，经鉴定为嗜肺军团菌Lp1型。 结论 深圳市中央空调冷却塔存在军团菌的污染，需引起重视，防止军团菌病发生。
关键词:军团菌;嗜肺军团菌;冷却塔;污染状况
Detection of Legionella pneumophila in cooling tower water of central air conditioning system in Shenzhen City.ZHANG Ran，CHEN Gui-bing，SHI Xiao-lu，et al.（Shenzhen Municipal Center for Disease Control and Prevention，Shenzhen518020，Guangdong，P.R.China）
Abstract:Objective To investigate the contamination status of cooling water of central air conditioning syatem with Legionella pneumophila in in hotels，buildings and subways in Shenzhen City. Methods Cooling tower water samples from central air condi-tioning system were randomly taken，cultured and then Legionella pneumophilia was isolated.Pobymerase chain reaction（PCR）was used for confirmation of the differentiation. Results Twenty-eight cooling water samples were collected and a strain of Legionella pneumophilia serovar Lp1was isolated. Conclusion The water in cooling tower of central air conditioning system in Shenzhen City has been contaminated with Legionella pneumophilia and measures be taken for preventing infection with Legionella pneumophilia.
Key words:Logionella;Leginella pneumophilia;Cooling tower;Contamination status
军团菌是引起军团菌病的一种急性呼吸道传染病的病原体，于1977年在美国首次发现并证实。现已分离到军团菌属（Legionella）共有42个种，64个血清型，其中与人类关系最为密切的是嗜肺军团菌，由它引起的肺炎，如未及时治疗，病死率很高 ［1］ 。空调机的冷却塔水、喷水池水、淋浴池和宾馆的养鱼池水，甚至游泳池水均是军团菌其生存定居的小环境，如果该小环境中的微型生物群落结构能与其构成共生关系，军团菌就可以大量繁殖，然后通过流动水，冷却塔喷雾漂移或小泡喷射及蒸发作用产生的含菌气溶胶传播感染于人群。目前军团菌病已成为危害人群健康的一种重要疾病。本文对深圳市中央空调冷却塔水军团菌的污染状况进行调查，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要仪器 低温高速离心机（型号:Stratos），干浴器（型号:MD-OZN），超速离心机（型号:1-13），双槽PCR扩增仪（型号:MJR PTC-220），凝胶成像系统（DYY-8C电泳仪BiolMAGING SYSTEM）。
1.1.2 主要试剂 GVPC和BCYEα培养基购自法国的BiomRriEux，军团菌诊断血清购自英国的OXOID生 物公司，嗜肺军团菌（Legionellapneu mophi la，Lp）1-14分型，PCR扩增反应所用的试剂10×PCR Buffer，dNTP Mixture，Taq酶，6×Loading Buffer，Marker购自大连宝生物工程有限公司，GoldView TM DNA染料购自上海中科开端生物芯片科技股份有限公司。
1.2 方法
1.2.1 水样采集 从10～12月，随机采集宾馆、大型写字楼、地铁等的中央空调冷却塔水样，每个塔分东西南北四个点，离壁5cm，离水面10cm深处各采水约100ml，水样装于500ml同一灭菌广口瓶内，共采集中央空调冷却塔水28份。
1.2.2 水样预处理 离心将水样富集（12000rpm/10min，26℃）至5ml浓缩液，然后取lml浓缩液于试管中，加入等量的pH2.0的0.01mol/L盐酸液混合，静置5～10min后用0.03mol/L的氢氧化钾液（约0.2ml）中和至pH约6.9作酸处理。
1.2.3 军团菌分离培养 取0.1ml酸处理混合液接种于GVPC琼脂平板上，用三角环推干后放入5%CO 2 培养箱中，37℃孵育3～7d观察结果，挑可疑菌落做鉴定。
1.2.4 军团菌的鉴定 在GVPC琼脂平板上菌落形态符合，革兰染色为阴性细长杆菌者同时接种于BCYEα和血平板上，在BCYEα平板长菌，在血平板上不长菌者，初步可认定为军团菌。通过初步鉴定的菌株进行氧化酶、触酶、马尿酸盐水解、明胶液化、糖发酵、尿素酶等生化试验，然后用血清凝集鉴定分型及PCR鉴定。
1.2.5 PCR引物设计 根据文献报道 ［2］ ，设计5SrRNA基因引物序列检测军团菌属，MIP基因的引物序列检测嗜肺军团菌。
1.2.6 模板处理 将水样浓缩液吸打震荡混匀后取1ml到EP管，离心（12000rpm/5min），弃去上清液留沉淀，加无菌蒸溜水30μl，100℃干浴10min，然后冰浴5min，取10μl上清液做为PCR扩增的模板。
1.2.7 PCR扩增 用5SrRNA和MIP两套引物分别扩增，PCR扩增在热循环仪上进行，循环参数为:加热至95℃5min，变性94℃45S，复性501min，延伸72℃1min20S，36个循环，4℃保存。5SrRNA预计扩增片段为105bp，Mip预计扩增片段为650bp。产物检测用含GoldView TM DNA染料的琼脂糖凝胶（1.5%）电泳，利用DNA分子量Marker确定产物分子量大小。
2 结果
2.1 分离培养结果 本次共检测中央空调冷却塔水28份，其中宾馆冷却塔水样13份、地铁冷却塔水样9份均未检出军团菌，大型写字楼冷却塔水样6份检出1株嗜肺军团菌，为Lp1型，此株嗜肺军团菌的鉴定结果表现为氧化酶、触酶、马尿酸盐水解、明胶液化等试验均为阳性，不分解葡萄糖、果糖、麦芽糖，尿素酶试验阴性。以及与Lp多价及Lpl标准血清呈阳性反应。结果见表1。
表1 空调冷却塔水军团菌检验结果（略）
Table1 Results of detection of Legionella from cooling tower water of central air conditioning system
2.2 PCR结果 本次调查，所有样本均同时采用传统的细菌学检验方法和聚合酶链反应（PCR）来鉴定。传统的细菌学方法从酸处理后接种平板开始到分离菌株一般要10d才可以分离出来，费时难培养且易被污染。PCR方法则是从细菌的基因水平入手 ［2］ ，比以 往所有传统的细菌学检验方法更为可靠，快速，简易，灵敏度高。本次PCR结果，28份冷却塔水检出军团菌属PCR（5S）阳性8份，检出嗜肺军团菌PCR（MIP）阳性1份，与上述分离培养的1株嗜肺军团菌Lpl型结果一致。PCR检测结果见表1。
3 讨论
3.1 军团菌自空调系统冷却塔水国内较多的北京、上海的阳性率一般达30%左右，地铁甚至高达45%。而此次调查空调冷却塔水嗜肺军团菌检出率较低，其原因可能与军团菌生长有季节性和采样时机有关。3.2 此次自28份冷却塔水，检出1株嗜肺军团菌，显示深圳市中央空调冷却塔的军团菌污染的存在。建议加强对环境水中军团菌的监测，同时开展健康人群军团菌抗体水平调查，了解本市人群中军团菌的感染情况，为今后对军团菌感染的预防研究提供参考资料 ［3］ 。
3.3 此次分离采用传统分离培养和PCR两种方法。其中PCR方法的阳性率高，尤其是针对5SrRNA设计的属特异性引物，PCR的阳性率高于传统检测方法。PCR方法灵敏度高，除能检测活菌外，还可检测已死亡的菌体DNA，因此若水中存在极微量的军团菌或死菌时，PCR方法能检出，但传统分离方法却是阴性。另PCR引物SSrRNA不但能检测致病性军团菌，也能检测非致病性军团菌，方法的敏感性高和有高度特异性，与传统方法吻合率高，适合作为传统检测方法的补充，提高检测速度和准确度。
3.4 军团菌病因为人体吸入含军团菌的气溶胶导致呼吸系统损害的疾病，冷却塔的循环水（含无机盐，有机物和微生物）不仅为军团菌提供了理想的生存环境，而且提供了传播的形式一气溶胶，冷却塔水被该污染后，通过空调机入口，门窗和通风管被抽入室内或在冷却塔一定范围（200M内）形成气溶胶，人因吸入而被感染。由于军团菌是一类水生菌群，生存环境界限广泛，水中存活时间较长，因此水质跟踪监测及水的消毒十分重要，可采取加氯，加热，化学药品，臭氧，紫外线，金属电离等消毒法并投入杀藻剂，使大致菌量低千10 3 cfu/L，消除污染的气溶胶来源。
参考文献:
［1］陈悦，沈建民，王刚毅，等.军团菌和军团菌病研究进展［M］.2003，17.
［2］宋勇，康晓明，李珍大.基因扩增法检测军团杆菌DNA的研究［J］.江苏医药，1994，20（19）:466.
［3］王琳，李丽云，万超群.空调系统冷却塔水分离军团菌报告［J］.中国医科大学报，2000，29（1）:25～29.
作者单位:深圳市疾病预防控制中心，广东深圳 518020.