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摘要:目的 建立一种快速测定食品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠的高效液相色谱法。 方法 以LiChrospher C 18 柱，甲醇:乙酸铵为流动相，研究3种物质的色谱分离特性，并对食品样品的前处理方法进行探讨。 结果 建立了快速、有效的分离和样品处理方法。3种物质的浓度在0～0.100mg/ml之间呈线性关系，相关系数0.999以上，且准确度、重现性好。3种物质的回收率为90.0%～107.5%，日内相对标准偏差为2.86%～4.75%。应用于多种食品样品的测定结果令人满意。 结论 该方法可以用于食品样品中3种物质的测定。
关键词:食品;苯甲酸;山梨酸;糖精钠;高效液相色谱法
Simultaneous determination of benzoic acid，sorbic acid and saccharin sodium in food by using high performance liquid phase chromatography.
PENG Ju-cheng.
（Baoan District Center for Disease Control and Prevention of Shenzhen City，Shenzhen518101，Guangdong，P.R.China）
Abstract:Objective To establish a method for fast determination of benzoic acid，sorbic acid，saccharin sodium in food. Methods C 18 column was used for separation and the preparation of food sample was discused. Results A method for determina-tion of benzoic acid，sorbic acid，saccharin sodium in food was developed.The concentrations of the three materials were between0～0.100mg/ml showing linear relation（r=0.999），This method is accurated and good reproductive.Their recoveries were among90.0%～107.5%，relative standard deviates were2.86%～4.75%in one day.The results in determination of food samples were sat-isfactory. Conclusion This method was simple，fast and accurate，and can be applied to the determination of food samples.
Key words:Food;Benzoic acid;Sorbic acid;Saccharin sodium;High Performance Liquid Chromatography
为了增加食品的保存时间及口感，常在食品中添加适量防腐剂、甜味剂。食品中防腐剂和甜味剂的测定方法有紫外分光光度法、气相色谱法及薄层色谱法等 ［1］ 。国标检测方法有高效液相色谱法 ［2，3］ ，但使用其推荐的色谱条件时，色谱分离的时间太长，不利于常规的实验室分析;同时国标法中，测定苯甲酸、山梨酸和糖精钠的高效液相色谱法中样品处理只是提到了汽水、果汁和配制酒类，而对于其它的样品处理方法没有提及。
我们选用了一种粒径更小的C 18 柱进行研究，寻找到一种更为快速有效的分离方法;同时对国标方法中没有提到的样品类型的样品前处理进行多种探讨和实验。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂 HP1050高效液相色谱仪（包括二极管阵列检测器、自动进样器、四元泵及HPLC化学工作站），Milepore simplicity纯水机。色谱纯甲醇，经纯水机处理的纯净水，所用标准均从国家标准物质研究中心购得。苯甲酸和糖精钠为1.00mg/ml水溶液，山梨酸为固体标准，纯度为99.0%。称取山梨酸固体标准0.1010g加入少量乙醇溶解，用水转移并定容至100ml，配成1.00mg/ml。使用时用水将3种标准配成混标。其余试剂均为分析纯试剂。
1.2 色谱条件 色谱柱:LiChrospher100RPl8e，5μm，125×4mm，柱温为室温，进样量10μl;检测波长:230nm;流动相:甲醇+0.02mol/LNH 4 AC=5+95;流速:1.0ml/min。以保留时间和吸收光谱定性，以色谱峰峰面积定量。
1.3 样品处理
1.3.1 对于碳酸饮料、果汁及果汁饮料、茶饮料等直接或稀释后经0.45μm针头式过滤器过滤进样。含二氧化碳的应先加热驱除二氧化碳。对于果冻类样品可以采取取果冻中的液体部分，直接或稀释后过滤、进样。
1.3.2 对于固体样品，将样品粉碎、混匀后称取5.0g于50ml具塞比色管中，加少量水溶解浸泡，加入1.0mol/L的NaOH溶液1.0ml，放置过夜或于超声波清洗器中超声振荡10min后加水定容至刻度。
1.3.3 对于含蛋白质多的样品在1.3.2的基础上加入10%的铁氰化钾和20%的乙酸锌各2.0ml后再定容至刻度，自然沉淀。
1.3.4 对于含油脂较多的食品，可以采用正己烷萃取，脱去样品中油脂，一般情况下均不需要。将浸泡、沉淀后的样品溶液用滤纸初步过滤后再用0.45μm的滤膜过滤，进液相色谱分析、测定。
2 结果分析
2.1 色谱条件的选择 为了在短时间内提供快速的分离，本文选用了一种粒径比国标推荐方法更小的5μm的填料的C 18 柱来分离3种物质。研究后发现，在同样的甲醇比例下，3种物质可以很快的出峰。
2.1.1 甲醇和乙酸铵的比例不同对色谱分离的影响 通过改变流动相中甲醇和0.02mol/L乙酸铵的比例观察相邻峰即苯甲酸与山梨酸，山梨酸与糖精钠之间的分离度。其分离情况随甲醇比例的变化如图1（略）。
2.1.2 甲醇含量对3种物质的保留时间的影响 甲醇含量越高，3种物质在色谱柱上的保留时间越短，分离时间越短;甲醇含量对3种物质保留时间的具体影响如图2（略）所示。
通过观察甲醇含量对分离的影响，发现在甲醇含量为5%时有较好的分离度和合适的保留时间，我们最终选择甲醇与0.02mol/L乙酸铵的比例为5:95。
同时在实验中发现，如果在柱子长时间未用，或平衡时间尚不充分时会出现糖精钠和山梨酸的峰位置颠倒现象。如果是采用二极管阵列检测器的多个波长检测时就会很容易识别，因为山梨酸的灵敏度在254nm比在230nm时明显要高得多，而在230nm时两者有相近的灵敏度，往往不容易发现。
2.1.3 流速对3者分离情况的影响 通过改变不同的流速，观察在不同情况下的分离情况发现:流速在 0.4ml/min和1.5ml/min之间变化时，相邻峰的分离度变化在10%以内，糖精钠的出峰时间在4.75～17.95min之间变化。经过综合考虑柱压和分析时间，选择1.0ml/min的流速作为分析时的流速。3种添加剂的色谱分离情况如图3（略）。
2.2 方法考察
2.2.1 线性范围 本实验中测定的3种物质的浓度在0～0.100mg/ml之间存在良好的线性关系，相关系数在0.999以上。其线性方程分别为苯甲酸:A=26524C+0.2，r=0.9995;山梨酸:A=59643C-11.8，r=0.9991;糖精钠:A=38763C-5.2，r=0.9999。
2.2.2 方法检出限 采用3倍信噪比时所对应的浓度，由此计算出3种物质的检出限分别为:苯甲酸0.0005mg/ml，山梨酸0.0005mg/ml，糖精钠0.0006mg/ml。山梨酸在254nm的吸收值较在230nm的吸收值大，由于采用的是二极管阵列检测器，在实际测定中也可以考虑在各自的最大波长处测定，以提高灵敏度。
2.2.3 干扰实验 常见的色素如亮蓝、靛蓝、赤藓红、靛蓝及甜蜜素及柠檬酸、酒石酸、草酸、抗坏血酸、咖啡因等不干扰测定;同时初步的实验结果发现，柠檬黄、苋菜红、胭脂红和日落黄均在3种物质之后出峰，选择适当的梯度洗脱程序应当可以同时分离4种色素。
2.3 准确度实验 按照本文所列的方法对国标中没有列明的样品种类进行了加标回收实验测定结果如表1。表1 加标回收实验结果（略）
2.4 重复性实验 取粉碎混匀的月饼样品，分别称取8份相同质量的样品，分别加入3种标准混合溶液适量，按照1.3.2中所列的样品前处理方法处理后测定。3种成分测定的相对标准偏差分别为苯甲酸3.52%、山梨酸2.86%、糖精钠4.75%，测定结果的偏差均在允许的范围内，说明经过该种方法处理后测定的重现性良好。
3 结论
在实际工作，面对大量的样品，提供1种快速有效的分离测定至关重要。该方法选择1种小粒径的填料的色谱柱，快速地分离了3种添加剂，且只需5%的甲醇比例就可以在较短时间内完成分离测定工作。用本文建立的方法同时测定食品中3种食品添加剂，方法简单、快速，精密度、准确度及灵敏度都符合卫生检验分析的要求，可以用日常食品样品的检测工作。
参考文献:
［1］翟永信.现代食品分析手册［M］.北京:北京大学出版社，1988，379～393.
［2］国家技术监督局.食品中糖精钠的测定方法［A］.GB/T5009.28-2003.
［3］国家技术监督局.食品中山梨酸、苯甲酸的测定方法［A］.GB/T5009.29-2003.
［4］仲岳桐.高油脂食品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠样品前处理的方法改进［J］.中国卫生检验杂志，2001，11（4）:471.
作者单位:深圳市宝安区疾病预防控制中心，广东深圳 518101.
收稿日期:2005-01-28