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摘要:目的 通过建立华支睾吸虫成虫cDNA文库，筛选其功能基因，以研制华支睾吸虫的药物靶标。 方法 应用SMART方法构建华支睾吸虫成虫cDNA文库，进行大量EST测序，然后应用生物信息学方法分析EST序列。 结果 从华支睾吸虫成虫cDNA文库中筛选出Cdc42样蛋白基因。 结论 应用生物信息学方法从华支睾吸虫成虫cDNA文库中筛选出Cdc42样蛋白基因。
关键词:华支睾吸虫;cDNA文库;EST Cdc42样蛋白;生物信息学
Screening the functional gene cDc42-like protein from adult clonorchis sinensis with bio-information methods.
ZHANG Hong-mei，YU Xin-bing，XU Jin，et al.
（Department of Parasitology of Basic Medical College，Sun Yat-sen Universi-ty，Guangzhou510080，Guangdong，P.R.China）
Abstract:Objective To screen functional gene through construction of the cDNA library of adult Clonorchis sinensis. Meth-ods The cDNA library of adult Clonorchis sinensiswere constructed with SMART method，then EST（expression sequence tag）se-quencing was carnied out and analyzed with bio-informatics software. Results Cdc42-1ike protein gene was screened from the cDNA library of adult Clonorchis sinensis. Conclusion Cdc42-1ike protein gene was screened from the cDNA library of adult Clonorchis sinensiswith bio-informatics method.
Key words:Clonorchis sinensis;cDNA library;EST Cdc42-1ike;Protein bio-informatics
华支睾吸虫病是广泛流行于东亚地区和我国大部分省市的人畜共患病，尤其在广东，华支睾吸虫病感染者约占全国的50%。目前，华支睾吸虫病的防治药物基因的储备国内外仍属空白，本文利用生物信息学从华支睾吸虫成虫cDNA文库中筛选Cdc42，以研制华支睾吸虫的药物靶标。
1 材料与方法
1.1 材料 华支睾吸虫成虫，TaKaRa MiniBEST Ani-mal Tissue Genomic DNA Extraction KitVer.2.0，SMART试剂盒。NCBI中的Unigen、保守结构域分析软件、PredictProtein、SWISS-MODEL分析软件。
1.2 方法
1.2.1 cDNA（质粒）文库构建 应用SMART方法构建华支睾吸虫成虫cDNA文库，与联合基因公司合作完成。
1.2.2 测序 联合基因公司完成。
1.2.3 生物信息学分析 Unigen、保守结构域在NCBI中的相关软件进行分析。WU-BLAST程序分析序列同源性。PredictProtein分析蛋白质修饰位点、功能域等特征序列，预测蛋白质的二级结构。ORFfinder软件。SWISS-MODEL进行建模。
2 结果
对华支睾吸虫成虫cDNA文库的大量EST（表达序列标签）序列，应用WU—BLAST程序进行同源性分析，UNIGENE电子延伸后，对有3'端测序结果的基因序列进行拼接，并用ORFfinder软件对开放阅读框（ORF）进行识别，从中筛选出华支睾吸虫Cdc42样蛋白。与马尼弗（氏）青霉菌Cdc42蛋白同一性48%，与黑腹果蝇Cdc42同一性50%，与褐鼠的同一性46%。2.1 保守域分析 应用NCBI中RPSBLAST程序分析Cdc42的保守域，结果如下:RPS-BLAST2.2.9［May-01-2004］ Query=localsequence:lclltmpseq_Oun-namedproteinprOduct（197letters）
2.2 MW和pI的计算 应用ExPASy的MW和pI计算工具，计算Cdc42的MW和pI理论值分别是21920.10、8.23。
2.3 Cdc42二级结构和三级结构的预测 把Cdc42序列提交PredictProtein及SWISS-MODEL，分别进行二级结构和三级结构及功能域的预测。结果见图2（略）。结果显示H（helix）占29.94%、E（extended:sheet）占22.34%、L（100p）占22.34%、L（loop）占47.72%。功能域有:ATP/GTP结合基序。
2.4 Cdc42的同源模建，见图3（略）。
Database:Cdd.v2.03 PSSMs producing significant alignments: Score （bits）
E value●gnl|CDD|14829 cd00157，Rho，Rho（Ras homology）subfamily of Ras-like small G... 230 le-61●gnl|CDD|5377 cd00154，RAB，Rab subfamily of small GTPases;Rab GTPases are... 115 4e-27●gnl|CDD|8937 smart00174，RHO，Rho（Ras homology）subfamily of Ras-like smal... 227 le-60●gnl|CDD|22694 smart00173，RAS，Ras subfamily of RAS small GTPases;Similar i... 115 3e-27●gnl|CDD|22695 smart00175，RAB，Rab subfamily of small GTPases;Rah GTPases a... 113 le-26●gnl|CDD|153 smart00176，RAN，Ran（Ras-related nuclear proteins）/TC4subfa... 58.93e-10●gnt|CDD|14910 smart00177，ARF，AR.F-like small GTPases;ARF，ADP-ribosylation... 35.0 0.005●gnl|CDD|25382 pfam00071，Ras，Pas family.Includes sub-families Ras，Rab，Ra... 166 le-42●gnl|CDD|16586 pram00025，Arf，ADP-ribosylation factor family... 51.76e-08●gnl|CDD|10822 COG1100，COG1100，GTPase SAR1and related small G proteins Ge... 111 8e-26●gnl|CDD|14829，cd00157，Rho，Rho（Ras homology）subfamily of Ras-like small GTPases;Members include Cdc42and Rac，as well as Rho isoforms;These proteins are all involved in the reorganization of the actin cytoskeleton in re-sponse to external stimuli;They also have roles in cell transformation by Ras，in cytokinesis，in focal adhesion formation and in the stimulation of stress-activated kinase;These various functions are controlled through distinct effector proteins and mediated through a GTP-binding/GTPase cycle involving three classes of regulating proteins:GAPs（GTPase-acti-vating proteins），GEFs（guanine nucleotide exchange factors），and GDIs（guanine nucleotide dissociation inhibitors）
3 讨论
Cdc42参与调细胞骨架-肌动蛋白的聚离，形成丝状伪足。Cdc42能控制淋巴细胞分化过程中TCR所导致的细胞骨架变化，尤其是调节T细胞向抗原提呈细胞（APC）分化过程中起重要作用;参与吞噬凋亡细胞的过程，能提高肥人细胞的分泌作用;调节细胞转录;也与磷脂酰代谢的调节有关。而华支睾吸虫Cdc42的研究未见报道。
本文应用SMART方法构建华支睾吸虫成虫cD-NA文库，并测序。应用WU-BLAST程序对产生的大量EST（表达序列标签）进行同源性分析，初步推测所筛选基因编码的蛋白与Cdc42同源。进一步应用NCBI上的RPSBLAST程序，将Cdc42氨基酸序列提交给PSBLAST进行保守域比对分析。结果表明Cdc42的同源物是Rho家族成员，具有GTP酶活性，在细胞的信号转导通路中作为信号转换器或分子开关，作用于细胞骨架或其靶蛋白而产生多种生物效应。在上述分析的基础上，利用PredictProtein程序对所筛选的Cdc42的二级结构及功能域进行预测、分析表明Cdc42具有ATP/GTP结合基序。这个分析结果，进一步证明了从华支睾吸虫成虫cDNA文库中筛选的基因编码的蛋白是Cdc42样蛋白。根据所获得的华支睾吸虫成虫Cdc42样蛋白的生物信息，将通过实验进一步分析、验证其生物学活性，为研制华支睾吸虫的药物靶标打基础。
参考文献:
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基金项目:本课题获广东省团队项目《人类基因组计划:模式生物（人体寄生虫）功能基因组研究》的资助.
作者单位:中山大学基础医学院病原学教研室，广东广州 510089.
作者简介:张红梅（1967～），女，博士，主要研究方向是生物工程，现工作于深圳市东湖医院深圳市肝病研究所.
收稿日期:2005-04-10