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摘要:目的 探讨HBV各基因型与DNA水平及HBeAg关系，分析不同基因型引起不同的临床表现。 方法 对108例HBV-DNA阳性患者进行基因分型、HBV-DNA定量检测、ELISA法检测HBeAg及肝功能检查后综合分析。 结果 基因分型为B型29例，C型51例，混合型16例，D型4例和未分型8例;C型HBV-DNA水平和HBeAg阳性率分别为（6.87±1.55）log值和74.51%，明显高于B型的（5.32±1.04）log值和44.83%（P<0.01）;C型发展为慢性乙型肝炎（CHB）、肝硬化（LC）和原发性肝细胞癌（HCC）分别为49.0%、17.6%、13.7%，明显高于B型的41.4%、6.9%和3.4%（P<0.05）;乙型肝炎病人中C型ALT、AST、TBIL和γG水平及发病年龄等均高于B型（P<0.05）。 结论 广州地区HBV基因型以C型为主，B型次之。C型HBV-DNA水平显著高于B型，B基因型HBeAg阳性率较C基因型高。C型肝脏损害比B型严重。
关键词:肝炎病毒，;乙型;基因分型;HBV-DNA;HBeAg
Investigation of the relationship of hepatitis B virus gene type and HBV-DNA level with clinical manifestations.
OU Ying-yan，YANG Hai-hong，ZENG Wen-ting，et al.
（Division of Infection of First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College，Guangzhou510120，Guangdong，P.R.China）
Abstract:Objective To investigate the relationship between hepatitis B virus genotype and serum level of HBVDNA and HBeAg.analyze different HBV genotype leading to the change of clinical manifestations. Methods The genotype of HBV and serum level of HBVDNA in108patients positive for HBV DNA were determined.ELISA was used for detection of HbeAg and liver function was also examined. Results 29patients were differentiated as genotype B，51genotype C，4genotype D，16mixed genotype and8undifferentiated.The clinical manifestations demonstrated that the serum level of HBVDNA HBeAg positive rate in pa-tients of genotype C was6.87±1.55and74.51%higher than5.32±1.04and44.83%in those of genotype B（P<0.01）.The occurrence rates of those developed to chronic hepatitis B liver cirrhosis and hepatoma in those of genotype C were49.0%，17.6%and13.7%higher than that of41.4%，6.9%and3.4%in those of genotype B（P<0.05）.The levels of ALT，AST，Tbill，γG and age.of onset in those of genotype C were also higher than that of those of genotype B. Conclusion Genotype C is a predomi-nated genotype and genotype B is the second in Guangzhou area.The serum level of HBVDNA in those of genotype C is higher than that of genotype B.The positive rate of HbeAg in those of genotype B is higher than that of genotype C.The damage to liver induced by genotype C is severe than that of genotype B.
Key words:Hepatitis;Genotype;HBVDNA;HBeAg
乙肝病毒（HBV）基因型是长期点突变累积形成的，由于HBV在逆转录过程中的不对称转录和缺乏校对酶的作用，HBV突变率较高，基因型反映了HBV自然感染时发生变异的特点，是病毒变异进化的结果。根据HBV全基因序列异质性≥8%的界线，可将其分为不同的基因型。目前，已鉴定的HBV基因型有A～H八种。近年的研究表明，HBV基因型与疾病的临床表现、治疗效果及预后有密切的联系。本文应用PCR微板核酸杂交，ELISA技术对108例乙型病毒性肝炎患者进行了HBV基因分型，旨在探讨HBV基因型与HBV-DNA水平与HBeAg的相关性及其临床意义。
1 材料与方法
1.1 病例选择 2003年7月～2005年7月，广州医学院第一附属医院感染病科108例HBV-DNA定性阳性的乙型病毒肝炎患者，包括急性乙肝、慢性乙肝、重型乙型肝炎及乙肝肝硬化和乙肝后肝癌（诊断标准均符合2000年第十次全国病毒性肝炎会议修订的病毒性肝炎诊断标准，并排除混合感染其它类型肝炎病毒的肝炎），其中男77例，女31例，记录患者年龄，留取血清标本作基因分型、肝功能、乙肝两对半、HBV-DNA定量检测。
1.2 HBV-DNA水平的检测 采用荧光定量PCR技术。Taq酶、dUTP和UNG酶购自上海华美生物工程公司。标准品，阴、阳性对照物，PCR缓冲液等购自上海复星实业公司。引物序列由上海申友公司合成。荧光定量基因扩增仪为瑞士LightCycler公司生产，配备Version5132分析软件，自行处理相关数据。按照HBV-DNA>10 3 作为阳性判定标准，两次均为阳性者作为研究对象。
1.3 HBV-DNA基因分型检测 采用第一军医大学基础部生物医学诊断研究中心的HBV基因分型微板核酸杂交试剂盒，对HBV-DNA定性检测阳性标本进行基因分型。具体操作为取处理液100μl于0.5ml离心管内，加待测血清100μl，混匀，100℃煮沸15min，12000r/min离心5min，取上清12μl于反应液管内，弹匀，10000r/min离心10S，上机，预变性94℃2min;循环条件为94℃50S、55℃50S、72℃65S，共循环38次，最后72℃延伸3min（阴性、阳性参照同标本处理）。取扩增产物变性98℃10min，迅速冰浴10min。各取杂交液90μl、已变性产物20μl、各型核酸探针25μl分别加入反应孔内，同时设空白对照（只加4滴杂交液及显色探针25μl），轻轻摇动混匀，50℃水浴60min，轻轻倒净液体。于每孔中加入杂交洗液200μl，50℃3～5min，轻轻倒净再重复洗两次。每孔加显色剂A、B各1滴，避光，置37℃10min后加入终止液2滴，结果判定按P/N值（标本OD值/阴性参照OD值）<3.0为阴性，P/N值≥3.0为阳性。6型杂交孔中，哪一型样孔呈阳性结果，则所检病毒基因为该型。
1.4 肝功能的检测 采用全自动生化分析仪检测白蛋白、球蛋白、总胆红素（TBIL）、丙氨酸转氨酶（ALT）、天门冬氨酸转氨酶（AST）等。
1.5 检测HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc等采用ELISA法，试剂由上海实业科华生物技术有限公司提供。
1.6 统计学方法 采用SPSS11统计软件，作t检验，χ 2 检验并进行分析。
2 结果
2.1 乙肝病毒基因分型的分布 基因分型分布B型29例（26.9%），C型51例（47.2%），混合型（C+D/B+C）16例（14.8%），D型4例（3.7%），未分型8例。
2.2 乙肝病毒基因分型与其DNA水平及HBeAg关系 C型和混合型HBV-DNA水平显著高于B型;C型与混合型HBV-DNA水平则无显著性差异;B基因型HBeAg阳性率较C基因型高。见表1。
表1 HBV基因型与HBV-DNA水平及HBeAg的关系（略）
注:*表示与B型比较，P<0.01。
2.3 乙肝病毒基因分型与临床表现的关系 C型与B型发展为慢性乙型肝炎（CHB）、肝硬化（LC）和原发性肝细胞癌（HCC）比例显著高于B型，见表2。
表2 乙肝病毒基因分型与临床类型关系比较（略）
注:*表示基因B型与C型比较，P<0.05。
2.4 HBV基因型与肝损害程度关系 针对B、C型进行TBILL、ALT、AST、γG、ALB、发病年龄均数间的两两比较。将B型和C型统计学结果报告如表3。
表3 HBV基因型与肝损害程度的比较（略）
注:※表示基因B型与C型比较，P<0.05，※※表示基因B型与C型比较，P<0.01。
3 讨论
HBV基因型呈一定的地理区域性分布，我国发现有B、C、D基因型，偶有A型。其中以C型和B型为主，北方主要是B型。本研究发现广州地区基因型以C型为主，B型次之，另有C+D/B+C混合型，与文献报道相似 ［1］ 。由于本研究只检测A～F六个基因型，发现有8例未分型。在实验中排除各种干扰因素，发现有DNA强阳性（HBV-DNA>10 7 ）无法归属6种基因型者8例，从而考虑我国有可能存在A～F基因型以外的基因型。
本研究结果显示C型与混合型HBV-DNA水平显著高于B型，C型与混合型HBV-DNA水平则差异无显著性。C基因型HBeAg阳性率较B基因型高，与文献报道相似 ［2，3］ 。混合型中均有C型存在，提示C型HBV-DNA复制较活跃。本结果显示，A、B型比C型患者HBV的HBeAg阳性率低，提示C型HBV-DNA复制较活跃，易形成持续病毒血症，不易发生e系统的血清转换。Kao等发现C型基本核心启动子（BCP）变异高于B型，Lindh等研究 ［4］ 也显示基因型C与B相比，前者与A1896突变率及第1762～1764位TGA突变有关，不同基因型HBV的复制能力以及逃避宿主免疫的能力是不同的，目前关于不同HBV基因型间生物学特异性差异的研究还仅限于前C区和C区突变以及对HBeAg血清学转换的影响。
通过对B、C基因型患者TBIL、ALB、γG、ALT、AST及发病年龄等比较，结果显示B型慢性乙肝患者趋于年轻化，平均年龄24.33岁;C型慢性乙肝患者趋于高龄化，平均年龄40.67岁。其中TBILL、ALT、AST、γG C型比B型高，各项均有差异显著性，C型ALB比B型低，说明C型肝脏损害明显比B型严重。同时，根据研究结果可知C基因型肝炎后肝硬化的发生率比B型高，C型肝细胞癌的发病率较B型高。有研究认为，C基因型与B型相比，C型临床预后较差，多次急性发作HBeAg又没有血清转患者在C型出现率较高，而在所有272例患者中，仅1次急性发作后血清学就转换或HBeAg一开始就阴性和没有急性发作的病人中C型较少 ［5］ 。C型由于持续的HBeAg阳性，维持高病毒复制水平，造成肝损害比B型严重，肝硬化的发生率比B型增高。在包括对490名慢性乙型肝炎中国患者的研究中发现，C型与病情加重发展为肝硬化可能密切相关。中国和日本学者发现HCC的出现与C型有密切相关，特别是年龄>50岁的HCC以C型多见。由于HBV基因型间的分子生物学特征、地理分布以及临床转归不同，深入研究基因型对于进一步明确HBV的分子流行病学特点，鉴别传染源，确定传播关系，阐明发病机制和临床治疗具有重要意义。
参考文献:
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