食品和水源微小隐孢子虫18S rRNA鉴定方法研究

    摘要:目的 了解生蔬食品及相关水源微小隐孢子虫污染情况，并研究其卵囊分离及18S rRNA鉴定的方法。 方法 采用分步离心富集法从78份生蔬食品和相关水源中分离出微小隐孢子虫卵囊并提取DNA模板，利用微小隐孢子虫18S rRNA的基因序列设计特异性引物（446bp）进行多聚酶链反应扩增，扩增产物经回收克隆后进行PCR鉴定、酶切鉴定及序列同源性分析。 结果 从78份样品中检出4份特异性条带样品。限性样品的重组克隆经PCR鉴定可重现446bp的特异性条带，其酶切产物亦与目的基因PCR产物位置相同。重组菌液的测序结果与Geabank数据库中微小隐孢子虫18S rRNA基因序列的同源性为99%。 结论 建立了一种监测生蔬食品及相关水源中微小隐孢子虫污染的基因检测方法。
   
　　关键词:微小隐孢子虫;18S rRNA;聚合酶链反应

　　Identification of Cryptosporidium parvum18S rRNA in food and water.

　　GENG Yi-jie，GAO Shi-tong，HUANG Da-na，et al.

　　（Shenzhen Municipal Center for Disease Control and Prevention，Shenzhen518020，Guangdong，P.R.China）
   
　　Abstract:Objective To isolate Cryptosporidium parvumoocysts from food and water and identify its18S rRNA. Methods 78food or water samples were enriched and Cryptosporidium parvumOocysts was isolated.DNA was extracted and specific primers for the18S rRNA of Cryptosporidium parvumwas used in polymerase chain reaction（PCR）.The amplified products were cloned and analyzed by PCR，digested with restriction enzyme and sequenced. Results 446bp PCR products were observed by agarose gel electrophoresis from the78samples.After cloning，the positive samples were identified by PCR and restriction enzyme digest.99%of recombined clone DNA sequence were identical with18S rRNA gene of Cryptosporidium parvumwhen NCBI-Blasting. Conclu-sion A method for genetic etection of Cryptosporidium parvumfrom food and water samples was established.

　　Key words:Cryptosporidium parvum;18S rRNA;Polymerase chain reaction
      
　　隐孢子虫病是一种全球性的人畜共患寄生虫病，目前临床上还没有针对性的病原学治疗方法。虽然免疫力正常的人感染后引起的症状为自限性，但婴幼儿和免疫力低下者一旦感染，则可引起严重的胃肠炎并可危及生命。目前，该病已被列入世界六大腹泻病因之一，同时也是引起艾滋病患者死亡的重要病因之一。在已报道并被公认的12种隐孢子虫中，微小隐孢子虫是主要寄生于哺乳动物体内并可感染免疫正常人群的唯一虫种 ［1］ ，其传播途径以卵囊经粪-口、手-口途径为主，人体可通过水源、食物、接触和呼吸道途径而感染 ［2］ 。在欧美等发达国家，通过生活饮用水、娱乐用水等受原虫污染而引起的微小隐孢子虫感染爆发事件呈逐年上升趋势 ［3］ ，我国近年来对介水传播的原虫感染也有所重视。与其它介水传播性原虫相比，微小隐孢子虫因粒径小而被净水工艺除去的难度更大 ［4］ ，即使在滤过水中，卵囊的检出率也可达到35% ［5］ 。因此，隐孢子虫污染已经成为水源监测的重要指标。但是，生蔬水果等食物的隐孢子虫污染却很少引起重视，其实，人们因为食用生菜和未去皮水果而感染隐孢子虫病的可能性并不容忽视。因此，本研究以微小隐孢子虫18S rRNA基因为靶基因，调查了78份随机抽取的生蔬水果、食品加工用水和饮用水源的污染情况，旨在建立一种监测食品水源隐孢子虫污染的基因检测方法，为完善有关饮食卫生标准提供依据。

　　1 材料与方法
   
　　1.1 材料 检测样本来源于深圳市四大行政区50家饮食店、果蔬市场和学校采集的水样和果蔬样品。其中，直饮水17份，生产加工用水16份，自来水末梢水15份，蔬菜13份，水果17份，共计78份。水样采集量为2L，果蔬采样参见GB/T4789.1-2003《食品卫生微生物检验》进行;菌株BL21为本研究室保存;pGEM-T载体购自北京天为时代;PCR纯化试剂盒购自北京塞百盛;质粒提取试剂盒为深圳伊诺金公司生产;限制性内切酶EcoR I、Taq DNA聚合酶、dNTP及Marker均由TaKaRa公司提供;引物合成及DNA测序由上海生工完成。

　　1.2 方法
   
　　1.2.1 样品处理和卵囊分离 将采集来的样品分为两类进行预处理。将水样室温静置48h后轻缓倾去上层水样，倾倒时尽量勿使液体发生扰动。将余下的约500ml水样分装于50ml离心管，5000rpm离心10min后去除上清，向管底加入1ml TE缓冲液（pH7.4），重悬混匀后合并同一份样品的10管重悬液。再次离心5000rpm10min，去除上清后向管底加入蛋白酶K（5mg/ml TE溶液）150μl，重悬并转移入1.5ml离心管，37℃过夜，置4℃保存;果蔬样品用蒸馏水仔细清洗，注意蔬菜的叶片、根节和水果的根蒂部位。将每份样品的洗液收集入同一烧杯，用纱布过滤，滤液分装于50ml离心管，5000rpm离心5min后去除上清，向管底加入5ml TE缓冲液（pH7.4），重悬混匀后合并同一份样品的重悬液。再次离心5000rpm5min，去除上清后向沉淀中加入蛋白酶K（5mg/ml TE溶液）250μl，重悬并转移入1.5ml离心管，37℃过夜，置4℃保存。
   
　　1.2.2 DNA模板制备 向上述粗提DNA中加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的pH5.2NaAc，混匀，-20℃20min。13000rpm离心20min。弃上清。加入75%乙醇300μl洗涤沉淀，13000rpm离心5min弃上清。置37℃烘箱至无乙醇气味，加入20μl无菌水溶解。
   
　　1.2.3 目的基因的PCR扩增 根据微小隐孢子虫的18S rRNA基因序列设计一对引物，上游引物为:5'-AA-CACGGGAAAACTCACCAG-3'，下游引物为:5'-GTACAA AGGGCAGGGACGTA-3'。通过反应条件优化，PCR反应体系为:10×PCR缓冲液2.5μl，25mM MgCl 2 2μl，2.5mM dNTP Mixture2μl。上下游引物各1.5μl（150μg/ml），Taq E0.25μl，DNA模板3μl，ddH 2 O12.5μl，总体积25μl。PCR反应条件为:94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃复性1min，72℃延伸1min，35个循环后72℃延伸10min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析，电压100V，时间20min。
   
　　1.2.4 扩增片段的回收、连接、转化 将经电泳鉴定后的PCR反应体系扩大为50μl体系，扩增后的电泳片段割胶后，用硅胶模型PCR产物纯化试剂盒回收纯化。用标准方法将扩增片段与PGM-T载体连接，16℃过夜，转化宿主菌BL-21，同时作感受态细胞空白对照。
   
　　1.2.5 重组菌液的PCR鉴定和质粒的酶切鉴定 将转化后的菌液涂布于含有Amp的LB固体选择培养基，同时设感受态细胞的Amp-空白对照（A组）和Amp+空白对照（B组），继续37℃培养16h后用无菌枪头挑取阳性克隆于1ml LB液体培养基（含1μl Amp）培养过夜。用前述反应条件，以菌液为模板进行PCR鉴定。另取阳性重组菌液20μl接种于5ml LB液体培养液（含5μl Amp），培养过夜后提取质粒，用EcoRI进行酶切鉴定。
   
　　1.2.6 阳性克隆序列分析 将阳性重组性菌液测序后用GeneBank进行序列分析。

　　2 结果
   
　　2.1 样品模板的基因扩增 经35个循环后，78份样品中有4份扩增出了目的基因片段，其中1份为饮食店的生产加工用水，其余3份均为蔬菜，总检出率为5.1%，蔬菜检出率23.3%。PCR产物的电泳结果表明，扩增出的特异片段长度与预计长度相等，为446bp。（图1）。
   
　　2.2 重组菌液的PCR鉴定 以转化后的阳性克隆培养液为模板，按同前的PCR条件扩增后的电泳结果表明，4份阳性样品的转化克隆均扩增出了目的片段（图2）。
 
　　图1 样品模板的PCR产物电泳图（略）
   
　　Fig1 Agarose gel electrophoresis result of PCR for sample
   
　　图2 重组菌液的PCR产物电泳图（略）
   
　　Fig2 Agarose gel electrophoresis result of PCR for recombinant clone

　　M:DNA maker;1:A组对照;2～5:阳性样品转化菌液;6:B组对照
   
　　2.3 重组质粒的酶切鉴定 经EcoR I酶切后重组质粒在琼脂糖凝胶上呈现两条电泳带，其中分子量大的电泳带与PGM-T载体位置相同，分子量小的电泳带则与目的基因片段大小相同（图3）。

　　图3 重组质粒的酶切鉴定图谱（略）
   
　　Fig3 Restriction map of recombinant plasmid with EcoR I
    
　　M:DNA maker;1:pGEM-T;2:pGEM-T/EcoR I
   
　　2.4 阳性重组克隆的测序分析
   
　　Cryptosporidium parvum strain CPF18S ribosomal RNA gene，com-plete sequence Length=1749
   
　　Score=868bits（438），Expect=0.0
   
　　Identities=444/446（99%），Gaps=0/446（0%）Strand=Plus/Plus
   
　　图4 重组菌序列同源性比较结果（略）
   
　　Fig4 Result of identification compared with Cryptosporidium parvumgene
   
　　3 讨论
   
　　目前，对于隐孢子虫卵囊的检测方法主要有免疫荧光检测，ELISA和PCR技术等 ［6］ ，而PCR技术与其它技术相比却具有优势，有研究提出PCR检测的敏感性和特异性可达到100% ［7］ 。但是，从混有多种复杂成分的植物和水源样品中扩增出微量的微小隐孢子虫基因片段却有赖于敏感而特异的靶基因及其引物的合理选择。由于18S rRNA基因在生物进化过程中具有高度的保守性，且不同虫株之间又有不同程度的变异。因此，本研究通过数据检索，选择微小隐孢子虫18S rRNA基因作为PCR扩增的靶基因。根据其基因序列设计的特异性引物可从微量的DNA模板有效的检出微小隐孢子虫卵囊的基因成分 ［8］ 。
   
　　关于水体污染原虫卵囊收集过程，美国国家环保局发布的1623方法虽然高效，但却需配备复杂昂贵的过滤洗脱和免疫磁分离设备 ［9］ ，目前只可能在我国部分发达城市的少数实验室推行。另外，对于极有可能原虫污染的生蔬水果，更是鲜有研究涉及。因此，探索一种方便有效而又灵敏特异的低成本隐孢子虫卵囊检测方法实属必要。
   
　　本研究采用分步沉淀和蛋白酶K裂解的方法处理食品及水源样本，操作简便，不需特殊的仪器设备和其它复杂技术。经纯化后的DNA模板可有效地用于特异性引物的PCR扩增。本研究微小隐孢子虫18S rRNA基因特异性引物，从78份随机抽取的食品及水源样品中检出了4份阳性样品。阳性样品的PCR产物经重组克隆后，不仅在PCR鉴定和酶切鉴定后重现了与目的基因片段相符的特异性条带，其测序结果也与目的片段达到了99%的同源性。说明从抽检样品中检出的阳性污染物确为可能导致人体感染的微小隐孢子虫卵囊。
   
　　在本次检出的阳性样本中，有3份来自于咖啡厅的蔬菜沙拉原料（青瓜、洋葱、生菜等），另1份为某饮食店的生产加工用水，而在直饮水和自来水末梢水中均未发现微小隐孢子虫的污染。据相关调查显示，由于深圳市采取了良好的原水保护和水厂管理，近年来均未发现饮用水源的致病性原虫污染 ［10］ 。某饮食店生产加工用水的微小隐孢子虫污染可能来源于不规范的生产加工过程，而本次调查的生蔬样品中微小隐孢子虫的污染率达23.3%，提示有关部门需重视原虫卫生指标的监测，而本研究所探讨的微小隐孢子虫卵囊检测及鉴定方法可供多数基层实验室推广应用，对于提高食品水源的原虫监测率具有积极的意义。

　　参考文献:
    
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　　［8］沈玉娟，曹建平，卢淮媛，等.微小隐孢子虫卵囊DNA提取及用于PCR检测［J］.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2005，23（4）:228～230.

　　［9］EPA-821-R-01-025，April2001Method1623;Cryptosporidium and Givdi a in water by filtration/IMS/FA［S］.
   
　　［10］余淑苑，张之诚，叶宝英，等.深圳市饮用水污水中隐孢子虫和贾第鞭毛虫的调查［J］.环境与健康杂志，2003，20（3）:156～157.