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摘要:目的 观察胶原蛋白制备基质网架的孔径、空孔率对成纤维细胞增殖的影响。 方法 胶原蛋白制备基质网架结构，在扫描电子显微镜下观察胶原网架的结构和网孔大小，将传代培养的成纤维细胞接种于胶原网架上，连续观察成纤维细胞和基质网架的动态变化。 结果 在扫描电镜下观察，胶原蛋白呈纤维状，错综连结形成许多网孔，网孔直径介于180～260μm之间，成纤维细胞可以自由通过网孔，为成纤维细胞提供生长空间和附着点。 结论 人工制备的胶原网架有明显的调节成纤维细胞增殖作用。
关键词:胶原蛋白;基质网架;成纤维细胞
Matrix sponge with collagen protein and its effect on proliferation of fibroblast.
SHEN Ci-shi，WANG Tian-li，WU Dao-shen，et al.
（Longgang District Chronic Disease Hospital of Shenzhen City，Shenzhen518172，Guangdong，P.R.China）
Abstract:Objective To observe the matrix sponge constructed with collagen protein on the diameter of micropores and rate of hollowfiber on proliferation of fibroblast. Methods Matrix sponge was constructed with collagen protein.Structure of matrix sponge and diameter of micropo-res were observed by using scanning electronic microscope（SEM）.The cultured fibroblasts through passage were planted in matrix sponge for continuous observation on the dynamic change of fibroblast and matrix sponge. Results The collagen protein showed fiberous and connected each other to form network pores with diameters of between180-260m.The fi-broblast could pass through the network pores freely，to provide growth space and attaching point for fibroblast. Conclusion The matrix sponge possesses significant effect of regulating the propagation and metabolism of fibroblast.
Key words:Collagen protein;Matrix sponge;Fibroblast
基质网架在组织工程学的研究中起着重要的作用，胶原蛋白具有易于降解和促进伤口愈合的生物学性能，本研究采用胶原原蛋白为材料制备了基质网架，观察其孔径、空孔率以及对成纤维细胞增值的影响。
1 材料与方法
1.1 胶原蛋白基质网架的制备 ［1，2］ 将0.3%I型胶原蛋白溶液（pH3.0）搅拌（2000转/min·30min），成泡沫状，移入35mm培养皿中，-40℃下速冻，铸型后冷冻干燥12h左右，然后抽真空，105℃条件下热交联24h，热交联结束后再用0.1%戊二醛溶液4℃条件下交联24h，以D-Hank's液浸泡1周，每天换液1次，除去过剩的戊二醛，用70%酒精清毒备用。
1.2 测量胶原蛋白基质网架网孔孔径 ［2］ 浸在D-Hank's液中的胶原网架，冷冻干燥后，在扫描电子显微镜下观察胶原网架的结构和网孔大小，每个标本测20孔的孔径，计算出基质网架网孔的孔径。
1.3 测量胶原蛋白基质网架空孔率 ［2］ 测量冷冻干燥后胶原网架的体积，按公式计算出空孔率。
空孔率=（浸润D-Hank's液时的重量一冷冻干燥后重量）/体积（cm 3 ）×100%
1.4 基质网架对培养成纤维细胞的影响 胶原网架放入35mm培养皿，将传代培养的成纤维细胞以2×10 5 /cm 2 密度接种于胶原网架上，37℃、5%CO 2 条件下培养。于培养的第5、10、15、20d分别用0.5%I型胶原酶消化，进行细胞计数，检测细胞增殖情况。于培养第1h、3h、1d、1周、2周、4周分别取培养人工真皮，10%福尔马林固定，HE染色，光学显微镜观察基质网架和成纤维细胞的形态结构。
2 结果
2.1 胶原蛋白基质网架的形态 在扫描电镜下观察，胶原蛋白呈纤维状，错综连结形成许多网孔。网孔直径介于180～260μm，即（222±43）μm之间，及空孔率（84±3.6）%与有关文献相近（表1～2），在胶原网架的另一面胶原纤维较密集，形成似膜状结构。在这上面植入角朊细胞用其制备复合培养人工皮肤时可以防止角朊细胞漏入网孔内。
表1 胶原蛋白基质网架网孔大小的比较（略）
表2 胶原蛋白基质网架的空孔率的比较（略）
2.2 胶原蛋白基质网架对皮肤成纤维细胞增殖的调节作用 把成纤维细胞接种于胶原蛋白基质网架内，在实验室培养条件下连续观察成纤维细胞和基质网架的动态变化。成纤维细胞于接种第1h，细胞呈圆形，只有少量散在分布于基质网架网孔内。培养3h，成纤维细胞呈梭形，已附着于网架上，在培养1周时细胞数量略增加，培养至第12周时仍可见到完整网架结构（表3）。
表3 植入基质网架中的成纤维细胞的增殖情况（略）
3 讨论
胶原蛋白在酸性条件下容易溶解 ［2］ ，先制成胶原蛋白的pH3.0的盐酸溶液经搅拌呈泡沫状，再经速冻、冷冻干燥形成海绵状网架。在扫描电镜下观察，胶原蛋白呈纤维状，错综连结形成许多网孔。网孔直径介于180～260μm之间，成纤维细胞可以自由通过网孔，为成纤维细胞提供生长空间和附着点。在胶原网架的另一面胶原纤维较密集，形成似膜状结构。在这上面植入角朊细胞用其制备复合培养人工皮肤时可以防止角朊细胞漏入网孔内，本文制备的胶原蛋白基质网架的空孔率与文献中所制备的基质网架空孔率相近 ［3，4］ 。
基质网架具有以下功能:①是表皮角朊细胞和真皮成纤维细胞附着的场地，为细胞贴壁、增殖和分化提供了立体空间。②在人工表皮移植中，该人工表皮的收缩现象明显，而以胶原蛋白基质网架为移植载体的人工真皮可以避免过度收缩。③带有胶原蛋白基质网架的人工皮肤新生血管容易长入 ［5］ 。
Yannas最初报告用不溶性胶原和GAG搅拌混合，冷冻干燥，再经戊二醛交联等程序所制备的细胞外基质网架进行移植后血管容易长入，随着细胞外基质的新生，移植的网架结构逐渐吸收，形成新生的真皮样组织。另外，添加带负电荷的GAG能与带正电荷的胶原形成多聚络合物，再经戊二醛交联，可以增加网架的强度，能加强网架对胶原酶的耐受性。制备网架的交联方法有应用15W紫外光灯照射交联法，这种网架于移植后1周就开始吸收，2周时已看不到网架结构。另外应用0.1%戊二醛交联的网架，可以降低网架的抗原性，并且使网架的分解变慢，移植后4周仍能观察到网架结构。本文选用了戊二醛交联方法制备基质网架。
把成纤维细胞接种于胶原蛋白基质网架内，在实验室培养条件下连续观察成纤维细胞和基质网架的动态变化。成纤维细胞于接种第1h，细胞呈圆形，只有少量散在分布于基质网架网孔内。培养3h，成纤维细胞呈梭形，已附着于网架上，在培 养1周时细胞数量略增加，培养至第12周时仍可见到完整网架结构。说明单纯成纤维细胞接种于基质网架培养时对于网架结构未产生破坏作用，这一现象可能与成纤维细胞在网架内的增殖较慢有一定联系。
这些结果在文献中曾有类似报道，如Kono用流式细胞仪（FACS）观察人工真皮中成纤维细胞的细胞周期，证明该成纤维细胞中处于M期和S期的细胞较少，而大多数细胞都处在G 0 期。这一发现提示与胶原蛋白相接触的成纤维细胞与在体内真皮中成纤维细胞增殖状态极为相似 ［1］ 。Holmas等研究也证明，天然真皮中的成纤维细胞是处于一种低活力状态，这些实验结果都表明在天然真皮层中可能存在着某些抑制成纤维细胞增殖的因素。黄金井应用真皮提取物添加在体外培养成纤维细胞的实验中也证明具有抑制作用。但是如果把培养人工真皮分离到的成纤维细胞接种于培养皿时，成纤维细胞增殖却极为旺盛。Yoshizato还直接证明胶原纤维本身有抑制成纤维细胞DNA合成和抑制细胞增殖作用。如果在培养皿底部预铺以胶原，然后再接种成纤维细胞进行培养，可以看到成纤维细胞的DNA合成能力与添加的胶原浓度有明显的负相关关系 ［6］ 。这些报到与本文的实验结果分别从不同的角度为胶原网架有明显的调节成纤维细胞增殖作用提供了证据。
参考文献:
［1］Yannas I.v，Burke，J.F.Design of an artificial skin.I.Basic design prin-cipies，Journal.Biomed［J］.Mater，Res，1980，14:65～81，
［2］刘杰，崔雪梅，张燕，等.利用不同支架材料构建人工真皮的研究［J］.中国修复重建外科杂志，2003，17（2）:104～107.
［3］Matsuda K，Suzuki S，Isshiki N，et al.Influence of glycosaminoglycans on the collgen sponge component of a bilayer artificial skin［J］.Biomaterials，1990，11:351-～355.
［4］Suzuki S，Matsuda K，Isshiki N，et al.Clinical evaluation of a new bilayer artificial skin composed of collagen sponge and silicone layer［J］.British Journal of plastic Surgery，1990:43:47～54.
［5］刘晋宇，侯立中，颜炜群，等.组织工程化人工复合皮肤的构建［J］.中国修复重建外科杂志，2001，15（4）:235～239.
［6］朱堂友，伍津津，胡浪，等.壳多糖-胶原-糖胺聚糖凝胶人工皮肤的初步研究［J］.中国修复重建外科杂志，2003，17（2）:113～116.