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摘要:目的 建立人血浆中奥美拉唑及5-羟奥美拉唑的高效液相色谱分析方法。 方法 对羟基苯甲酸乙酯为内标，待测血浆以二氯甲烷提取，并进行高效液相紫外检测，色谱柱为Kromasit C 18 ，5μm，4.6mm×150mm;流动相为0.1mol·L -1 乙酸铵-乙晴-甲醇（55:45:5），流速1.0mL·min -1 ，检测波长302nm，柱温:室温。 结果 血浆中奥美拉唑及5-羟奥美拉唑的线性范围分别为0.005～2.001mg·L -1 和0.02～1.20mg·L -1 ，相关系数分别为0.9989和0.9982，相对回收率分别为:93.2%～96.4%，92.5%～97.4%;日内日间变异均小于8%，最低检测限分别为0.005mg·L -1 及0.02mg·L -1 。 结论 HPLC法测定人血浆中奥美拉唑及5-羟奥美拉唑的浓度结果满意，可用于以奥美拉唑为探针药物，分析人群细胞色素氧化酶CYP2C19的表型多态性。
关键词:奥美拉唑;5-羟奥美拉唑;高效液相色谱法;血浆
Determination of the concentration of omperazole and its metabolite in human plasma by HPLC.
WANG Jiu-hui，LI Pei-qiong.
（Department of Pharmacology of Hainan Medical College，Haikou571101，Hainan，P.R.China）
Abstract:Objective To establish a HPLC method for determining the concentrations of omeprazole and its metabolite5-hy-droxyomeprazole in human plasma. Methods The internal standard was ethyl p-Hydroxybenzoate.Omeprazole and5-hydroxy-omeprazole were extracted with dichloromethane and then separated on Kromasit C 18 （5μm，4.6mm×150mm）with a mobile phase consisting of0.1mol·L -1 ammonium acetate:acetonitrile:methanol（55:45:5）.The flow rate was0.1mol·L -1 .The detection was set on302nm. Results The calibration curve was linear within0.005～2.001mg·L -1 for omeprazole and0.02～1.20mg·L -1 for5-hydroxyomeprazole.The relative recovery rates of omeprazle and5-hydroxyomeprazole were93.2%～96.4%and92.5%～97.4%，respectively.The RSD in a day and the RSD between days were both less than8%. Conclusion HPLC is s simple，rapid and accurate method for determination of the concentrations of omeprazole and5-hydroxyomeprazole in human plasma in addi-tion to the study of phenotype of cytochrome P4502C19in Hainan Li ethnic group.
Key words:Omeprazole;5-hydroxyomeprazole;HPLC;Plasma
奥美拉唑是H+泵抑制药，主要用于消化性溃疡的治疗。奥美拉唑在体内主要经肝脏细胞色素氧化酶系统的代谢，主要代谢产物为经羟化代谢生成的5-羟奥美拉唑和S原子氧化生成的奥美拉唑砜。奥美拉唑在人群中存在的羟化代谢多态性受CYP2C19遗传基因调控，已经被建议为细胞色素氧化酶CYP2C19的探针药物，可测定细胞色素氧化酶CYP2C19的表型 ［1］ 。本文建立可同时测定人血浆中奥美拉唑及5-羟奥美拉唑浓度的HPLC分析方法，经方法学验证及实测健康志愿者的血浆样本，证实可应用于研究细胞色素氧化酶CYP2C19的表型多态性。
1 材料方法
1.1 药品与试剂 奥美拉唑对照品，由海南省药检所提供;5-羟奥美拉唑对照品由中南大学临床药理研究所惠赠;对羟基苯甲酸乙酯对照品，由中国生物制品检定所提供;奥美拉唑肠溶片:规格20mg，批号08018，无锡阿斯利康制药有限公司生产。乙晴、甲醇均为进口色谱纯试剂，乙酸铵、二氯甲烷均为国产分析纯试剂，试验用水为双蒸水。
1.2 色谱条件 Waters高效液相色谱仪（包括1525泵、2487检测器、Breeze工作站）;旋涡混合器;色谱柱Kromasit C 18 ，5μm，4.6mm×150mm（北京润博公司）。流动相为0.1mol·L -1 乙酸铵-乙晴-甲醇（55:45:5）;流速1.0ml·min -1 ;室温;检测波长302nm。
2 结果
2.1 血浆样品预处理 精密吸取健康志愿者血浆样品500μl、内标50μl（对羟基苯甲酸乙酯的甲醇溶液，4mg·L -1 ），旋涡混合10s，加入二氯甲烷3.0ml、旋涡振荡2min，静置5min，负压吸取下层有机相，于40℃恒温水浴，氮气流吹干，残渣用流动相100μl溶解，吸取20μl进样，用峰高做定量分析。
2.2 标准曲线制备 精密吸取奥美拉唑标准贮备液，用空白人血浆稀释成浓度为0.005，0.05，0.1，0.3，0.5，1.0，2.0mg·L -1 的标准工作液，按“血浆样品预处理方法”及色谱条件进行进样分析，以奥美拉唑对照品浓度（mg·L -1 ）（X）为横坐标，奥美拉唑与对羟基苯甲酸乙酯峰高比值（Y）为纵坐标，进行直线回归计算，求得直线回归方程为Y（Height Ratio）=3.2769X（mount Ratio）-0.0837，n=7，r 2 =0.9989，在上述色谱条件下，奥美拉唑在0.005～2.0mg·L -1 范围内线性关系良好，血浆中最低检测浓度为0.005mg·L -1 。精密吸取5-羟奥美拉唑标准贮备液，用空白人血浆稀释成浓度为0.02，0.06，0.1，0.2，0.6，1.2mg·L -1 的标准工作液，按“血浆样品预处理方法”及色谱条件进行进样分析，以5-羟奥美拉唑对照品浓度（mg·L -1 ）（X）为横坐标，5-羟奥美拉唑与对羟基苯甲酸乙酯峰高比值（Y）为纵坐标，进行直线回归计算，求得直线回归方程为Y（Height Ratio）=0.964X（mount Ratio）-0.0094，n=6，r 2 =0.9982，在上述色谱条件下，5-羟奥美拉唑在0.02～1.2mg·L -1 范围内线性关系良好，最低检测浓度为0.02mg·L -1 。
2.3 方法的专属性 分别设置空白血浆、空白血浆中加入标准液与内标和健康受试者血浆进行HPLC。奥美拉唑、5-羟奥美拉唑与内标对羟基苯甲酸乙酯在8min内得到良好分离，血浆中无内源性物质干扰测定。内标和奥美拉唑、5-羟奥美拉唑保留时间分别为7.8min和5.8min、2.9min。结果见图1。
图1 人血浆中奥美拉唑和5-羟奥美拉唑色谱图（略）
A:空白血浆;B:空白血浆加入标准品;C:健康志愿者服药后血浆样品
Fig1 Chromatograms of omeprazole and5-hydroxyomeprazole in human plasma
A:blank plasma;B:blank plasma spiked standard;C:plasma sample of healthy volunteer
2.4 精密度试验 取空白血浆500μl置于离心管中，分别加入奥美拉唑标准贮备液，使血药浓度为0.05，0.50，2.00mg·L -1 ，每种浓度做5份，按”血浆样品预处理方法”及色谱条件进行测定。日内变异试验5个浓度的供试品在同1d内进行;日间变异试验为每天重新配制3个浓度的供试品，在5d内分别进样分析并计算日内、日间RSD。结果日内平均实测浓度分别为（0.047±0.0018）mg·L -1 ，（0.52±0.002）mg·L -1 ，（1.97±0.0303）mg·L -1 ;RSD分别为3.66%，1.96%，2.30%（n=5）。日间平均实测浓度分别为（0.047±0.0006）mg·L -1 ，（0.51± 0.0006）mg·L -1 ，（1.98±0.0084）mg·L -1 ;RSD分别为0.81%，0.46%，0.61%（n=5）。
取5-羟奥美拉唑标准贮备液，用空白血浆稀释成浓度为0.06，0.60，1.20mg·L -1 的标准工作液，按“血浆样品预处理方法”及色谱条件进行测定，方法同奥美拉唑精密度试验。结果:日内平均实测浓度分别为（0.055±0.006）mg·L -1 ，（0.59±0.011）mg·L -1 ，（1.15±0.019）mg·L -1 ;RSD分别为5.06%，1.58%，3.20%（n=5）。日间平均实测浓度分别为（0.058±0.0037）mg·L -1 ，（0.57±0.0076）mg·L -1 ，（1.22±0.028）mg·L -1 ;RSD分别为5.12%，1.08%，3.42%（n=5）。
2.5 回收率试验 配制0.05，0.50，2.00mg·L -1 3种浓度的奥美拉唑标准血浆样品和0.06，0.60，1.20mg·L -1 3种浓度的5-羟奥美拉唑标准血浆样品，分别按“血浆预处理方法”处理后与相应浓度的奥美拉唑标准工作液、5-羟奥美拉唑标准工作液分别进样分析并进行色谱峰高比较，求得奥美拉唑在血浆中的绝对回收率和相对回收率分别在68.7%～78.4%和93.2%～96.4%之间，5-羟奥美拉唑在血浆中绝对和相对回收率分别在72.8%～80.1%和92.5%～97.4%之间。
2.6 稳定性试验 配制0.05，0.50，2.00mg·L -1 3种浓度的奥美拉唑标准血浆样品和0.06，0.60，1.20mg·L -1 3种浓度的5-羟奥美拉唑标准血浆样品，置于-20℃冰箱中冷冻保存，每隔5d取出全部冰冻样品，放置室温使其溶解，分别按“血浆预处理方法”处理，并进样测定其含量。余下样品放入冷冻室，共测5次。结果奥美拉唑血浆样品平均实测浓度分别为（0.048±0.007）mg·L -1 ，（0.47±0.009）mg·L -1 ，（2.04±0.014）mg·L -1 ;RSD分别为3.76%，1.65%，2.20%（n=5）;5-羟奥美拉唑平均实测浓度分别为（0.061±0.004）mg·L -1 ，（0.57±0.009）mg·L -1 ，（1.308±0.018）mg·L -1 ;RSD分别为3.66%，1.68%，5.42%（n=5）。
2.7 应用评价 用上述方法对163例海南黎族志愿者口服20mg奥美拉唑胶囊后，于2h采血，离心，收集血浆样本进行了检测。测得奥美拉唑的血浆浓度范围为0.013～1.4mg·L -1 ，5-羟奥美拉唑的血浆浓度范围为0.025～1.05mg·L -1 ，以羟化指数C奥美拉唑/C5-羟奥美拉唑为分型指标，其中137例的羟化指数范围为0.11～5.59，26例的羟化指数范围为7.62～24.59，以羟化指数>5.6为阈值，CYP2C19弱代谢者（PM）表型在中国黎族的发生率为16.6%。
3 讨论
本文改进文献 ［1，2］ 同时测定人血浆中奥美拉唑及其代谢物5-羟奥美拉唑的HPLC法，流动相中的磷酸盐缓冲液换为乙酸铵，采用对羟基苯甲酸乙酯为内标，减少试验的误差。方法简便、专一，操作易行，具有良好的灵敏度和重现性，在方法应用中测定羟化指数得满意结果。可适用于以奥美拉唑为探针药物，研究细胞色素氧化酶CYP2C19的表型多态性及临床奥美拉唑血药浓度的测定或药动学研究。
参考文献:
［1］付良青，黄丰.中国健康志愿者的奥美拉唑及其代谢产物的药代动力学［J］.中国药理学与毒理学杂志，2003，17（1）:51～54.
［2］楼雅卿，赵莉.中国健康志愿者的奥美拉唑及其代谢物的药代动力学研究［J］.中国临床药理学杂志，1994，10（1）:14～21.