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Home医源资料库在线期刊中国热带医学杂志2006年第6卷第8期

我国弓形虫病核酸疫苗研究概况

来源:中国热带医学杂志
摘要:China)刚地弓形虫(简称弓形虫)呈世界性分布,哺乳动物及鸟类普遍易感。人类对弓形虫有较强的自然免疫力,感染后绝大多数无明显症状表现,或只出现亚急性弓形虫病。但在孕妇及免疫功能低下者(如ADIS病、器官或组织移植后接受免疫抑制剂治疗的病人等)感染弓形虫后引起的危害严重。人体弓形虫感染日益受到关注,弓形虫......

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  Status in the research of nucleic acid vaccine against toxoplasma in China.

  XU Feng-quan,LIN Ling.

  (Shandong Provincial Institute of Parasitic Diseases,Jining272133,Shandong,P.R.China)
     
    
  刚地弓形虫(简称弓形虫)呈世界性分布,哺乳动物及鸟类普遍易感。人类对弓形虫有较强的自然免疫力,感染后绝大多数无明显症状表现,或只出现亚急性弓形虫病。但在孕妇及免疫功能低下者(如ADIS病、器官或组织移植后接受免疫抑制剂治疗的病人等)感染弓形虫后引起的危害严重。人体弓形虫感染日益受到关注,弓形虫病疫苗成为当前研究的热点。动物实验发现,弓形虫全虫疫苗,弓形虫特异抗原组分疫苗有预防弓形虫感染或降低感染度作用,但前者可能会引起再感染,后者的免疫保护效果较差。弓形虫病核酸疫苗克服了上述疫苗存在的不足,具有良好的开发应用前景。我国从上世纪90年代后期开始了弓形虫病核酸疫苗的研制,通过对表达保护性抗原蛋白基因进行重组,先后研制出弓形虫基因单价疫苗、复合疫苗和混合疫苗。动物实验证明部分疫苗具有良好的免疫预防效果。
   
  1 保护性抗原及目的基因研究
   
  弓形虫裂殖了表面膜蛋白(SAG) [1,2] ,致密颗粒蛋白(GRA) [3] 和棒状体蛋白(ROP) [4] 是重要的弓形虫抗原,这些抗原物质与弓形虫的侵袭性有关,且能诱导宿主的免疫反应。

  1.1 SAG SAG是弓形虫裂殖子表面膜蛋白。通过对SAG的分子结构、生物学和免疫学特性研究发现,有5种(分别命名为P22、P23、P30、P35利P43)与弓形虫病免疫有关。
   
  1.1.1 P30(SAGl) P30分子质量30~35kDa含量约占虫体总蛋白的3%~5%,主要存在于弓形虫表膜及内膜系统,也可分泌到虫体外环境。P30是重要的弓形虫表面膜蛋白,与虫体的吸附和入侵有关,能被弓形虫急性感染期及恢复期血清抗体识别。动物实验证明,用纯化的P30蛋白免疫小鼠可显著提高小鼠抗弓形虫感染能力 [5] 。为提高免疫效果,于瑾等 [6] 构建了含有霍乱毒素A2/B亚基基因和P30基因的重组表达质粒,转化宿主菌BL2l后经IPTG诱导产生30-CTA2/B融合蛋白。游东生等 [7] 将P30重组表达质粒转化入DH5α,Westernblot证明IPTG诱导表达的P30抗原分子能被抗弓形虫血清识别。
   
  1.1.2 P22(SAG2) SAG2是一个基因家族,包括SAG2B、SAG2C和SAG2D。其中SAG2B表达于速殖子表面,而SAG2C和SAG2D仅表达于缓殖子的表面。研究证明,P22蛋白参与弓形虫的入侵过程,并且与弓形虫速殖子向缓殖子的转化有关。P22的抗原性较弱,但仍能提高免疫动物的免疫水平。姚永伟等 [8] 用PCR法从RH株弓形虫基因组DNA中扩增P22基因编码序列,克隆入载体pET-32a,转化大肠埃希菌BL2l,IPTG诱导的表达产物能被兔抗弓形虫血清识别。龙彩虹等 [9,10] 构建的P22重组质粒转化宿主菌的IPTG诱导表达产物也被证明具有良好的抗原性。

  1.1.3 P35 研究发现,P35蛋白的C端区(201~225及301~340号氨基酸)具有高亲水性,利用蛋白质分析软件分析P35基因编码的氨基酸序列,发现其编码的氨基酸序列含有多个T、B淋巴细胞表位,证明P35蛋白具有抗原性。林敏等 [11] 采用RT-PCR技术从弓形虫cDNA文库中扩增出编码P35抗原的基因片段,构建了弓形虫RH株表面抗原P35基因重组表达质粒P35/pGEX-21,并在大肠杆菌JMl09中成功表达了分子质量为70kDa融合蛋白,该蛋白能为谷胱甘肽S转移酶(GST)单克隆抗体及弓形虫感染的兔血清所识别。
   
  1.1.4 P23 与其它弓形虫表面腆蛋白不同,P23不是GPI锚定蛋白,P23的N端连接有糖基化位点,是慢性弓形虫病的一个分子标志。疫苗研究发现,24kDa的多肽物质能诱导产生一定的免疫保护力。用24kDa多肽免疫动物后,在该动物血液中检测到了抗P23抗体 [12] 。闪此认为P23可能包含该多肽的免疫表位,其基因序列可能存在同源性。是有希望的弓形虫病疫苗候选基冈。
   
  1.2 GRA 弓形虫致密颗粒秆放多种蛋白(GRA),已经报道的有8种,其中研究较多的有GRAl、GRA4、GRA6手GRA8。
   
  1.2.1 GRAl GRAl是慢性弓形虫病的标志性抗原分子。研究表明,GRAl可诱导免疫动物产生以IFN-R升高为特征的保护性细胞免疫应答。彭碧云等 [13] 将构建的GRAl基因重组质粒用脂质体介导,转染到小鼠巨噬细胞RAW264.7,光学显微镜观察形态学改变并绘制生长曲线。结果证明重组质粒的表达产物使巨噬细胞增殖能力增强。贾雪梅等 [14] 利用PCR技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出GRAl基因片段,成功构建了pEGFP-N3-GRAl真核表达重组质粒。
   
  1.2.2 GRA4 GRA4蛋白分子质量为40kDa,存在于弓形虫的致密颗粒及纳虫泡中,当速殖子分裂并侵入细胞时GRA4被分泌到细胞外,刺激机体免疫系统产生粘膜免疫及全身免疫。林绮萍等 [15] 根据GRA4基因序列,设计并合成PCR引物,扩增弓形虫GRA4基因片段,成功构建了原核表达重组质粒pGEX-4T-GRA4,该重组子在大肠杆菌中经IPTG诱导,表达分子质量为60.3kDa的融合蛋白,该蛋白能与免抗弓形虫血清发生反应。
   
  1.2.3 GRA6 GRA6分子存在于弓形虫的致密颗粒及纳虫泡,与裂殖子的入侵有关。朱翔等 [16] 采用聚合酶链反应从弓形虫昆山分离株和RH株总DNA中分别扩增到编码GRA6的基因,导入表达载体PGEX-5X-3,然后在大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RP中进行表达。经SDS-PAGE鉴定表达产物分子质量为49kDa,能被感染弓形虫者特异性IgM和IgG血清所识别。

  1.2.4 GRA7 GRA7为分子质量29kDa的致密颗粒蛋白,在弓形止速殖子、包囊及肠内期虫体均有分布。PCR分析表明,不同地理株弓形虫GRA7基因均具有保守性 [17] 。重组表达质粒pGEX-4T—I/GRA7转入大肠埃希菌BL21后经IPTG诱导,表达的GST融合蛋白具有GRA7的抗原性 [18] 。
   
  1.2.5 GRA8 一般认为,GRA8分子为弓形虫致密颗粒分泌蛋白。但Beghetto等 [19] 报道GRA8可能是P35。为研究GRA8的抗原性和制备高效的弓形虫核酸疫苗,袁仕善等 [20] 参照GRA8序列设计引物,采用PCR从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出编码GRA8的基因片段,分别亚克隆到原核表达质粒pGEX-4T-2和真核表达载体pVAXl上,经SDS-PAGE和免疫印迹分析结果表明致密颗粒抗原GRAS的原核表达质粒在大肠杆菌中表达了GRA8的融合蛋白,分子质量为41kDa:用提纯的真核重组表达质粒免疫小鼠(后腿肌肉注射,每周1次,每次50μg,连续2周),4周后检测证实免疫鼠产生了抗弓形虫抗原的抗体,ELSA滴度1:100。杨慧龄等 [21] 构建的pcDNA3.1(+)-GRA8重组质粒经PCR鉴定利测序分析,与GENEBANK相应基因序列完全一致。
   
  1.3 ROP 弓形虫棒状体可分泌棒状体蛋白(ROP),这些蛋白物质的产生与弓形虫入侵宿主细胞有关。已报道的棒状体蛋白有8种,国内研究较多的为ROP1利ROP2。
   
  1.3.1 ROP1 ROP1蛋白为单拷贝的ROP1基因表达产物,该蛋白物质能影响宿主细胞的通透性。杨秋林等 [22] 根据ROP1基因的碱基序列没计引物,从已构建的cDNA文库中筛选出了编码ROP1基因的cDNA片段,得到分子质量为70kDa的GST-ROP1重组蛋白,经鉴定该融合蛋白大小与预测值相符。
   
  1.3.2 ROP2 ROP2是一种保守蛋白,含有能被多个免疫个体所识别的T细胞表位,在弓形虫速殖子期、缓殖子期及包囊期表达的ROP2分广均能诱导宿主产生对弓形虫感染的免疫应答,主要表现为T细胞的增生和IFN-R的产生,是重要的疫苗候选因子。吴乩等 [23] 根据ROP2基因已知序列,设计合成一对PCR引物,从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出ROP2基因片段,再克隆到pGEX-4T-1质粒并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行ITPG诱导表达。经SDS-PAGE分析,ROP2基因PCR产物大小与预期相符约1043bp,测序结果与已知序列基本吻合:免疫印迹显示表达产物具抗原性。

  2 弓形虫病核酸疫苗研究

  2.1 单基因疫苗
   
  2.1.1 P30基因疫苗 占国清等 [24] 用大量制备的重组真核表层质粒pBK-P30,经生理盐水稀释至1μg/μl,1次肌注免疫BALB/c小鼠,通过测定免疫鼠脾脏T淋巴细胞转化率及CD4+、CD8+T细胞亚群变化观察弓形虫表面抗原P30DNA疫苗诱导小鼠产生的细胞免疫应答。结果免疫组小鼠CD8+细胞数量升高,CD4+/CD8+比率下降。表明弓形虫表面抗原P30DNA疫苗能诱导BALB/c小鼠产生细胞免疫应答。龚娅等 [25] 利用PCR技术和亚克隆技术分别构建了弓形虫表膜型P30基因重组质粒(个完整的P30编码序列,包括信号肽)pcDNA3-P30In,并将以上3种重组质粒分别与脂质体混合后免疫小鼠,之后的免疫检测证明3种表达形式的重组质粒均能诱导小鼠产生特异性的IgG抗体,虽然膜型及分泌型免疫鼠特异IgG抗体出现的时间早于细胞内型免疫鼠,但4周后的抗体水平3组间差异无显著性。
   
  2.1.2 P22基因疫苗 P22分子的抗原性引起了研究者的重视,P22基因已成为弓形虫疫苗研究的热点。高世同等 [26,27] 用 构建的pVAXl-SAG2真核表达质粒接种小鼠后,用RT-PCR方法从注射部位肌肉组织总RNA中扩增出SAG2目的基因条带;免疫小鼠血CD4 + 细胞数升高,并检测到血清抗弓形虫特异性IgG抗体。证明构建的SAG2真核表达重组质粒pVAXl-SAG2能在小鼠肌肉中转录表达P22蛋白,可诱导产生细胞免疫与体液免疫应答。龙彩宏等 [28] 将构建的真核表达重组质粒pVAXl-SAG2在质脂体介导下转染Vero细胞,Westen blot分析细胞裂解液样品有1条约17kDa大小的条带可被弓形虫免疫血清所识别。而高世桐等 [29] 构建的Pbk-P22基因重组表达质粒转化宿主菌后的诱导表达产物分子质量为28kDa,能被弓形虫感染猪血清抗体识别。由于所选择的质粒pBK-CMV既是原核表达质粒又是真核细胞表达载体,含有CMV真核表达启动子,因此认为所构建的pBK-P22表达质粒可能是一种理想的弓形虫DNA疫苗。

  2.2 复合基因苗
   
  2.2.1 P30-P22复合基因疫苗 单价疫苗显示了一定的免疫效果,但仍不能满足设计要求。为增强核酸疫苗的免疫效果,李瑛等 [30] 将弓形虫表面抗原P22、P30的有效基因片段同构建在同一克隆载体pUCl9和表达载体pGEMEXTM-1上,并保证其连接方向及开放读码框的正确。古饮民等 [31] 用IPTG诱导含有P22、P30复合基因的重组菌表达融合蛋白,并进行了免疫活性检测。结果在66.5kDa位置的融合蛋白带可与P30抗体特异结合,表明质粒重组体表达的融合蛋白与P30的抗原性相同。孙怡等 [32] 将构建的PCDNA3.1-P30-P22质粒通过肌内注射直接免疫小鼠,观察其诱导的体液免疫应答及保护性作用。结果免疫组小鼠血清抗体水平显著升高,攻击感染后小鼠存活时间显著延长。证明重组真核表达质粒pcDNA3.1-P30-P22经肌注即可诱导小鼠产生体液免疫应答,并能抵抗弓形虫感染。
   
  2.2.2 P30-ROPl复合基因疫苗 蒋华等 [33] 将弓形虫P30基因片段和俸状体蛋白(ROP2)的基因片段重组入pUCl8克隆载体,再将酶切的P30-ROP2外源基因片段亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体,成功获得pUCl8-P30-ROP2重组质粒。陈海峰等 [34] 用构建的SAGl和ROPl复合基因真核表达质粒接种小鼠,观察诱导产生的拮抗致死性弓形虫感染的保护性免疫。抗体及细胞因子检测结果表明,SAGl和ROPl复合基因疫苗诱导小鼠产生了很强的体液免疫和细胞免疫,接种该疫苗对于毒性株弓形虫感染攻击具有免疫保护作用。杨亭亭等 [35] 用构建的弓形虫SAGl-ROP2复合基因疫苗免疫小鼠后,观察了血中及T淋巴细胞变化。结果显示,免疫鼠血中和CD8 + 细胞数均高于用pcDND-SAGl重组质粒免疫鼠,免疫鼠感染弓形虫后的平均生存时间为(9.5±1.25)d,而用弓形虫pcDND-SAGl重组质粒免疫鼠感染弓形虫后的平均生存时间为(7±0.89)d,差异有显著性(P<0.05)。认为弓形虫SAGl-ROP2复合基因疫苗的免疫效果较好。
   
  2.3 混合基因疫苗 HbsAg是乙型肝炎疫苗的理想候选分子,能有效保护机体免受乙型肝炎病毒感染。HbsAg同时又是理想的基因工程疫苗的载体,在不同部位插入外源基因,能表达相应的HbsAg融合蛋白。HbsAg的佐剂作用能显著提高疫苗的免疫效果。王丹静等 [36] 将构建的pcDNA3-HBsAg-GRAl质粒经脂质体转染体外培养的COS-7细胞,转染后的细胞培养上清经SDS-PAGE,Western-blot鉴定证明,转染的细胞能高效表达分子质量为47kDa的分泌性融合蛋白(HBsAg-GRAl),该蛋白能同时被HBsAb阳性者血清及弓形虫免疫兔血清识别。霍乱毒素(CT)是常用的粘膜免疫佐剂,具有较强的粘膜免疫原性和佐剂放应,不仅能增强抗原的免疫原性,同时增强机体的免疫反应。丛华等 [37] 用构建的SAGl、SAG2和霍乱毒A2/B亚基基因真核重组质粒经后腿肌肉免疫BALB/C小鼠,每2周注射1次,每次100μg质粒。与不含A2/B亚基的P30-P22复合基因疫苗比较,用混合基因疫苗免疫3次后的小鼠血清抗体水平升高,脾淋巴细胞的增殖活性(体外淋巴细胞转化率)及NK细胞活性显著增强,免疫鼠感染弓形虫后的存活时间延长。说明A2/B亚基能有效增强弓形虫DNA疫苗的免疫效果。
   
  3 展望
   
  我国弓形虫病核酸疫苗研究进展较快,许多实验室已将研制的疫苗用于动物试验,显示了一定的免疫效果。但由于弓形虫单价抗原的免疫活性较弱,制备的单基因疫苗免疫动物后产生的免疫效果不够理想。因此,制备弓形虫复合基因疫苗已成为目前和今后的研究重点。通过寻找表达产物抗原性更强的候选基因和适宜的表达载体,构建多价、高效的复合基因疫苗,或含有基因佐剂的混合基因疫苗,提高弓形虫核酸疫苗的免疫保护效果。

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作者: 徐凤全 ,林玲 2007-4-26
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