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摘要:目的 探讨日本血吸虫疫苗侯选分子—钙离子激活的中性蛋白激酶（Calpain）的保护性免疫和免疫保护机制。 方法 用重组纯化的Calpain抗原免疫BALB/c小鼠，RT-PCR分析小鼠—氧化氮激酶（iNos.enos.nNos）mRNA的表达;ELISA分析免疫小鼠体外培养脾细胞产生的细胞因子IFN-γ和IL-4的动态变化。 结果 重组Calpain抗原免疫小鼠1周后，小鼠iNos mRNA的表达显著增强;培养24h免疫鼠脾细胞上清中IFN-γ浓度显著高于对照组，而IL-4的产生在免役组与对照组之间无显著性差异。 结论 Calpain抗原能诱导IFN-γ的产生，提示Calpain诱导Th1的免疫应答反应来抗日本血吸虫的感染。
关键词:日本血吸虫;细胞毒;Calpain;BALB/c小鼠
Kinetics of cytokine IFN-γand expression of IL-4in BALB/c mice immunized by calpain recombinant proteins.
LIU Man-qian，GAO Shi-tong，HUANG Da-na，et al.
（Department of Molecular Biology of Shenzhen Municipal Center for Disease Control and Prevention，Shenzhen518020，Guangdong，P.R.China）
Abstract:Objective To explore the protective immunity and mechanisms of Calpain，a calcium-activated meutral proteinase as a vaccine candidate molecule. Methods Anti-Calpain sera was prepared by immunizing ALB/c mice with recombinant puri-fied Calpain and mRNA expression of iNos，nNos and eNoswere detected by RT-PCR，and the concentration of of IFN-γand IL-4in spleen cell of culture of immunized mice were analyzed by using ELISA. Results High level of IgG antibody specific to the antigen was observed in mice immunized with recombinant calpain.The concentration of IFN-γin the supernatant of mouse spleen cell24hours after culture was significantly higher than that of control，while no significant differences were noticed in the production of IL-4in the immunized mice as compared with that of the control. Conclusion Calpain can induces the production of IFN-γ，suggesting that the immune response of Th1induced against infection with Schistosoma japonicum.
Key words:Schistosoma japonicum;Cytotoxicity;Calpain;BALB/c mice
血吸虫病在74个国家流行，有2亿多人感染血吸虫病，6亿多人暴露在血吸虫病感染之中 ［1］ 。由于化疗后的再感染，显示化疗不能有效阻断血吸虫病传播性，所以，发展血吸虫病疫苗是一个重要的综合控制血吸虫病措施。
日本血吸虫不仅危害人类，而且在野生动物和家畜中传播，尽管我国利用人畜同步化疗等措施在控制血吸虫病上取得了很大的成功，但血吸虫病仍然是我国长江中下游地区的一个主要的公共卫生问题。目前，控制血吸虫病关键是控制家畜对血吸虫病的传播，发展一个从动物再到人类的日本血吸虫病疫苗是一个科学的研究策略。日本血吸虫病疫苗侯选分子被广泛的筛选，这些侯选分子包括97kDa副肌球蛋白 ［2，3］ 和26kDa的谷胱苷肽（GST） ［4，5］ ，它们中的一些在小鼠的动物模型中表现出了减虫和减卵的保护性免疫力，但在家畜的动物模型中没有表现出—个高于40%的减虫效果，所以，筛选新的日本血吸虫病疫苗侯选分子很有必要。Renli Zhang et al报告日本血吸虫重组疫苗在抗日本血吸虫上有41%的保护效果，并有一定的抗病理发展的作用 ［6］ ，因此，进一步探讨其免疫机制很有必要。Calpain是一个钙离子激活的中性蛋白激酶，日本血吸虫Galpain的大亚基已被克隆和表达 ［7，8］ 。曼氏血吸虫Calpain的DNA疫苗表现出了—个高达60%保护性免疫力 ［9］ 。为了探讨日本血吸虫Calpain的保护性免疫力和免疫机制，我们观察了日本血吸虫Calpain抗体介导的对日本血吸虫童虫的杀伤作用及其被Calpain抗原免疫小鼠细胞因子的变化。
1 材料和方法
1.1 材料 日本血吸虫（中国大陆株）被保种在深圳市疾病预防控制中心寄生虫病防治科;6周龄的BALB/c雌鼠（中国南方医科大学实验动物中心）被用来作免疫接种和细胞因子分析。
1.2 方法
1.2.1 动物免疫 25μg的重组Calpain蛋白被溶解在磷酸缓冲液（PBS）中，与等体积的完全氟氏佐剂（CFA）（Gibco，Grand，Island，NY）充分混合，经皮下免疫小鼠，2周后，同量的重组Calpain蛋白与等体积的不完全氟氏佐剂（IFA）（Gibco）混合，经皮下加强免疫小鼠，再过2周后，同量的重组Calpain蛋白单独经皮下加强免疫小鼠。
1.2.2 Calpain免疫鼠脾细胞制备 无菌摘取正常鼠和免疫鼠的脾脏，置于盛含100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和2mol/ml谷氨酰胺的RPMI-1640培养液中，用无菌注射器柄碾碎脾肚，经200目尼龙网过滤，1000g离心10min，用pH7.2的Tris—NH 4 Cl溶液溶解红细胞，每次5min，共2次;再用RPMI-1640洗两次，脾细胞用10%FCS的RPMI-1640培养液调整到细胞浓度为1×10 6 /ml。脾细胞一部分用来分析细胞因子mRNA的表达，另一部分用来体外培养测定细胞因子的产生。
1.2.3 RT-PCR测定iNos的表达 免疫1周后，每组动物中取5只鼠的脾脏用于提取RNA，RNA的提取方法按照PUREscript试剂盒（Gibco）的说明进行，提取的RNA置-80℃保存备用。使用mRNA反转录试剂盒（Perkin-Elmer，Branchburg，Caiif.）用1μg mRNA在20μl的反应体积内合成iNos、enos和nNos第一条DNA，按照不同的条件PCR扩增lNos、enos和nNos基因。小鼠β-actin基因扩增来作为内部对照，PCR产物在2%的琼脂糖胶上电泳，溴化乙锭染色。
1.2.4 细胞因子测定 来自于免疫与对照组小鼠脾细胞1×10 5 /ml被培养在含10%FCS、RPMI-1640的培养基内，5%CO 2 37℃培养48h，并分别加入10μg/ml的ConA，10μg/ml Calpain抗原刺激培养，收集培养上清，用夹心ELISA定量试剂盒（Genzyme，Minneapolis，MN）测定IFN-γ和IL-4的产量。
2 结果
2.1 特异性抗体的产生 鼠被重组的Calpain蛋白免疫后，产生了一个高水平的特异性IgG抗体，当比较免疫鼠与佐剂控制鼠时，抗重组Calpain抗原的OD值分别为1.037±0.06和0.163±0.009（P<0.01）。
2.2 脾细胞培养上清细胞因子的产生 用Calpain免疫动物5周后脾细胞在ConA或Calpain抗原的刺激培养后，定量测定了培养上清中IFN-γ的产生情况，虽然ConA刺激时两组IFN-γ的产生在一个较高的水平，但免疫动物与控制组动物无差异;而Calpain抗原刺激时控制组与免疫组IFN-γ的产量有显著性的差异（免疫组比对照组:2.709±0.227:0.965±0.183，P <0.01）;免疫动物5周后进行日本血吸虫感染，感染6周后继续进行了IFN-γ的产生观察，但结果与上面的实验一致。然而IL-4的产生在Calpain免疫5周时测定两组动物无显著性差异，并处在一个较低水平，但感染日本血吸虫6周后，在控制组IL-4的产生显著上升，实验组在Calpain抗原刺激时反而下降，两组比较差异无显著性（图1）。
图1 免疫和控制对照鼠脾细胞在ConA（A，B）或重组Calpain（C，D）抗原刺激下细胞因子IFN-γ或IL-4产生的动态变化（略）
在3个不同的时间点上定量测定培养上清中细胞因子浓度，A，C为IFN-γ，B，D为IL-4的产生变化，圆圈为calpain免疫动物，方格代表控制组动物。Calpain免疫动物与佐剂控制组动物在IFN-γ有显著性的上升，而IL-4是有意义的下降（*P<0.05;**P<0.01）。
Fig1 Kinetics of cytokine producton in murine spleen cells stimulat-ed by ConA（A and B）or r-calpain（C and D）in r-calpain-immu- nized and adjuvant-treated control mice.
Cytokines were detected at three different time point.A and C refer to IFN-γproduction，and B and D refer to IL-4production.Cytokine profile of calpain-immunized mice are shown as circle，and those of adjuvant-treaed control mice are shown as open squares.A marked increase in calpain driven IFN-γproduction and a decrese in IL-4production were observed for the calpain-immunized group compared with the adjuvant-treated control group（*P<0.05;**P<0.01）.
2.3 iNos、eNos和nNos mRNA的表达 第二次加强免疫1周后，测定小鼠脾脏细胞内iNos、eNos和nNos mR-NA的表达，半定量比较分析三组动物iNos、eNos和nNos mRNA的表达差异，显示免疫组iNos mRNA的表达明显强于其它对照组（图2）。
3 讨论
这项研究通过用Calpain重组抗原免疫BALB/c小鼠来探讨Calpain疫苗候选分子的可能性保护性免疫机制，Renli Zhang等报道Calpain重组疫苗对在小鼠的动物模型中有39%的抗日本血吸虫感染的保护性 ［6］ ，本研究从细胞因子的动态表达来探讨Calpain免疫后的作用效果，同时从日本血吸虫攻击感染后免疫动物细胞因子的动态变化来比较研究细胞因子在保护性免疫中的作用，同时分析Calpain诱导的免疫应答类型。
图2 RT-PCR测定calpaIn免疫和佐剂控制鼠一氧化氮激酶（NOS）mRNA的表达（略）
设计不同的引物用来扩增不同的一氧化氮激酶亚型（eNos，nNos and iNos）扩增片段分别为254，404和449bp，348bp的小鼠β-action作为内部对照（图A），在免疫和佐剂控制鼠之间iNos的表达有显著性的差异（图B）。
Fig2 RT-PCR detection of mRNA for nitric oxide synthase（NOS）isofroms in r-calpain immunized and control mice
Primers were detected by unique sequences in each isotbrm and pro-duced fragments of254，404，and449bp，respectively，for enos，nNos and iNos transcripts.A348bp fragment of actin was as a control（A）.A significant control difference of iNos mRNA expression be-tween calpain-immunized mouse and control was shown（B）.Solid bar is immunized group and open bar adjuvant alone control（P<0.02）.
Hota-Michell等报道曼氏血吸虫Calpain疫苗候选分子在BL-6小鼠诱导了IFN-γ的高度产生，特别是Calpain DNA重组疫苗体系有一个高达60%的保护性免疫效果，IFN-γ的产生显著性的高于对照组。本实验结果与Hota-Michell的报道一致，但我们首次证明了日本血吸虫Calpain的初步的保护性免疫机制。James等报道了一氧化氮介导的杀灭肺部阶段日本血吸虫童虫的保护性免疫机制，在减毒尾蚴的免疫模式中，较高产量的IFN-γ激活主要的效应细胞产生一氧化氮杀灭肺部阶段日本血吸虫童虫 ［10］ ，本实验表明在Calpain免疫小鼠脾细胞有高度iNos的表达，暗示一氧化氮参与了对日本血吸虫童虫的杀灭作用，与一 些关于曼氏血吸虫疫苗免疫机制的报道相一致;但其它的一些出版物亦报道了抗体介导的效应机制，在血吸虫病流行区，老年组的感染率低于少年组，抵抗再感染的能力也有所提高，通过血清流行病学调查发现老年群体血清中含有较高的IgE和较低的IgG4抗体 ［11，12］ 。
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