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Investigation into the reactivation of bacterium preserved in preserving tube.
LI Yu-wei，LI Feng-qin，ZHAO Xi，et al.
（Institute of Nureition and Food Safety of China National Center for Disease Control and Pre-vention，Beijing100021，P.R.China）
摘要:目的 观察砂土管长期保藏的黄曲霉菌种的复活情况及生物学特性。 方法 将砂土管保藏27年的菌种分别用PDA倾碟法和接种到查氏斜面，置（28±1）℃温箱培养7d。经转种活化并与新鲜的黄曲霉菌种进行菌落形态和显微镜下的形态观察。 结果 用PDA倾碟法活化的菌种复活株有34株，复活率为84%，将菌种接种于查氏斜面上的菌种复活株有24株，复活率为60%。 结论 砂土管保藏的菌种活化后无论在菌落大体形态或者显微镜下观察，均与标准的黄曲霉菌株无明显的差异。
关键词:黄曲霉;砂土管保藏;存活率
保藏菌种的目的是将菌种经过长时间保藏后，依然能保持着生活能力并不污染杂菌，其形态特征和生理性状尽可能不发生变异或少变异，为科研工作多年后有着延续性和深入性。本实验室早在1978年用砂土管保藏法，将广西扶绥县分离的100株黄曲霉菌种保藏至今，27年后我们将这100株黄曲霉菌种进行了活化、分纯和鉴定。为今后长期保藏霉菌工作奠定了良好的基础。
1 材料与方法
1.1 材料 砂土管保藏菌种来自本实验室;黄曲霉菌种3.389购自中国科学院微生物研究所;马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基（PDA）购自北京三药科技开发公司;中国药品生物制品检定所监制。培养皿:青岛阿尔发医疗器械有限公司;智能型霉菌培养箱:宁波市机电工业研究设计院;涡旋器:1600转/min美国。
1.2 方法
1.2.1 PDA倾碟法 用无菌操作法将砂土管保藏菌种加入9ml灭菌蒸馏水内，在涡旋器上振荡30s，将黄曲霉菌的孢子尽可能打散均匀，静置10min后，取清夜1ml，加入平皿内，共做2个平行平皿。待PDA培养基45℃时，做倾注培养，置（28±1）℃温箱内培养，从第5d开始观察，第7d观察并记录结果，同时做空白对照 ［1］ 。
1.2.2 斜面培养法 用接种环挑取少量孢子同时接种于普通查氏培养基斜面上2支，置（28±1）℃温箱内培养，从第5d开始观察，第7d观察菌落生长的大体形态及显微镜下观察并鉴定 ［2］ 。
1.2.3 纯培养 将活化好的菌种点种在麦芽汁-琼脂培养基、查氏-酵母膏-琼脂培养基、查氏-琼脂培养基平板上，置（28±1）℃温箱内培养，第2d在一个点种点上，用切刀挖一小槽继续培养，从第5d开始观察，第7d观察菌落生长的大体形态及显微镜下观察并鉴定 ［3］ 。
2 结果
2.1 PDA倾注法 将100株保藏的黄曲霉菌种经PDA平板（28±1）℃培养7d后，有84株菌种在PDA平板上能够长出典型的黄曲霉菌落，菌落质地呈绒状，菌落颜色初期淡黄色，老后为绿色，反面无色至浅褐色。有的菌株能产生菌核 ［4］ （见图1）。
图1 保藏菌株在PDA平板培养第7d（略）
2.2 查氏斜面转种结果 用70株保藏的菌种同时接种在查氏斜面上，置（28±1）℃培养7d后，在查氏斜面上生长的黄曲霉菌落更为典型（见图2）。挑取少许在查氏斜面上生长的菌落制片后在显微镜下观察，其分生孢子梗光滑或近光滑，顶囊烧瓶形或近球形，瓶梗单层或双层，分生孢子近球形或亚球形，光滑 ［5］ （见图3～4）。
图2 保藏菌株在斜面培养第7d（略）
图3 保藏黄曲霉菌株-瓶梗单层结构（略）
图4 保藏黄曲霉菌株-瓶梗双层结构（略）
图5 标准黄曲霉菌株-瓶梗单层（略）
图6 标准黄曲霉菌株-瓶梗双层（略）
3 讨论
3.1 保藏菌种存活率的检出 将100株保藏27年的黄曲霉菌株，经PDA平板计数与转种在查氏斜面上，（28±1）℃培养7d后，在PDA平板上有84株保藏的菌种生长，其中检出存活菌数的范围在0.5×10 0 ～4.0×10 2 个/ml。有70株菌种同时转种在查氏斜面上并有45株菌种生长，占存活率的64.2%。
3.2 沙土管保藏菌株与标准菌株的比较
3.2.1 大体形态的观察 将保藏27年的黄曲霉菌种无论是在PDA平板还是在查氏斜面上均能够长出典型的黄曲霉菌落，将其转种在查氏琼脂平板上生长迅速，（25±1）℃培养7d菌落直径6.0cm～7.0cm，颜色为黄绿色，质地呈丝绒装、致密;有的稍呈絮状或中央部分呈絮状，有的菌落可产生菌核。标准黄曲霉菌落在查氏琼脂平板上生长迅速，（25±1）℃培养7d菌落直径4.0～7.0cm，质地主要呈致密丝绒状，颜色为黄绿色，初期较淡，老后稍深，有的菌株可产生菌核。
3.2.2 显微镜下的观察 保藏的黄曲霉菌种制片后，分生孢子头球形，孢梗茎壁厚，无色，光滑或稍粗糙，顶囊近球形，产孢结构双层或单层，分生孢子近球形，壁光滑或稍粗糙。标准黄曲霉菌株制片后，分生孢子头球形，孢梗茎壁厚，无色，粗糙至很粗糙;顶囊近球形至烧瓶形，产孢结构双层或单层，分生孢子球形或近球形，壁稍粗糙至具小刺。
4 小结
4.1 经沙土管保藏27年的黄曲霉菌种经PDA平板计数和查氏培养基转种后的存活率可达64.2%～84.0%，从而看出，用PDA平板计数培养较查氏斜面培养出的菌落存活率高于19.8%。
4.2 活化后的菌落无论在菌落大体形态，还是在显微镜下的观察，均与标准的黄曲霉菌株无明显的差异。
4.3 真菌菌种保藏方法有滤纸保藏法、土壤保藏法、斜面保藏法及沙土管保藏法，前三种保藏法最长可达14～17年，而保藏27年以上的方法还未见报导。本实验室此次的实验结果证明了，用沙土管保藏真菌菌种能为科学研究提供保藏真菌菌种的良好方法，沙土管保藏真菌菌种即经济又方便且好保藏。
参考文献:
［1］GB/T4789.15-2003.北京:中国标准出版社，2003，08:103～104.
［2］GB/T4789.15-2003.北京:中国标准出版社，2003，08:110～111.
［3］中国科学院微生物研究所编.常见与常用真菌［M］.北京:科学出版社，1975，83～87.
［4］罗雪云.食品卫生微生物检验标准手册［M］.北京:中国标准出版社，1995，197.
［5］余永年.中国真菌志［M］.北京:科学出版社，1997，76～80.