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【摘要】 目的 观察双酚A对小鼠生殖内分泌系统的影响。 方法 小鼠经不同剂量的双酚A染毒3d后，用紫外分光光度法检测睾丸组织中乳酸脱氢酶(LDH)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)活性；放射免疫法测定血清雌二醇(E2)、睾丸组织内睾酮(T)水平。 结果 各染毒组LDH活性、T含量均明显低于阴性对照组(P<0.05)，且随着染毒剂量的增加而明显降低；4μmol/kg组G-6-PD活性较对照组明显升高(P<0.05)。雄性和雌性小鼠血清E2浓度随染毒剂量的增加而逐渐升高，当剂量达到80μmol/kg时，明显高于阴性对照组(P<0.05)。 结论 双酚A对小鼠具有一定的生殖内分泌毒性。
【关键词】 双酚A(BPA) 生殖 内分泌 睾丸 酶学 激素
Experimental observation on the impact of BPA on reproductive endocrine system of mice.
DU Juan, HU Miao, CUI Ke-qin.
(Department of Labor and Environment of Jilin Medical and Pharmaceutical College, Jilin 132013, Jilin,P. R.China)
Abstract：Objective To observe the effects of BPA on the reproductive endocrine system of mice. Methods Tthree days after treatment of mice treated with different doses of BPA, the activities of LDH and G-6-PD in the testis of mice were determined with spectrophotometry. The level of estradiol in serum and testosterone in testis of mice was determined with RIA. Results The LDH activity and T level in mice treatment with different doses of BPA were significantly lower than that in the control group (P<0.05),and it decreased along with the increasing of the BPA dose. The activity of G-6-PD in the mice of 4μmol/kg group was significantly higher than that in the control group (P<0.05). E2 concentration in serum of male and female increased along with the increasing of the BPA dose. When the BPA dose reached 80μmol/kg, E2 concentration was significantly higher than that in the controls (P<0.05). Conclusion BPA can affect the reproductive and endocrine system of mice.
Key words：BPA；Reproduction；Endocrine；Testis; Enzymology；Hormones
双酚A(Bisphenol A BPA)化学名4-二羟基二苯基丙烷, 分子量228，白色晶体，低等毒性，结构与雌激素类似，是动物实验已经明确的一种激素活性物质［1］。它被广泛应用于生产碳酸聚酯、聚苯乙烯树脂、塑料制品等工业产品中，可通过食品包装容器或塑料薄膜渗入食品或饮料而进入体内，干扰机体内分泌系统，对人体产生有害作用［2］。目前国内对BPA的研究多集中于其雌激素样作用上，而对BPA的生殖内分泌毒性研究还比较少。本实验通过观察不同剂量BPA染毒后小鼠体内乳酸脱氢酶(LDH)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)活性变化和生殖内分泌激素雌二醇(E2)、睾酮(T)水平的改变，以探讨BPA对小鼠生殖内分泌的毒性作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物 昆明种小鼠50只，体重(25±2)g，雌雄各半，由吉林大学白求恩医学部实验动物中心提供。
1.2 染毒药品制备 BPA溶于丙酮后，用色拉油稀释，配成浓度分别为0.5μmol/ml、2.5μmol/ml、5μmol/ml、10μmol/ml的溶液，4℃冰箱保存。
1.3 仪器和试剂 752型紫外分光光度计(山东高密分析仪器厂)；电动组织匀浆器(江苏省东台县安丰电器厂)；MTX-150低温高速离心机(上海安亭科学仪器厂)；FJ-2008γ免役计数仪(国营二六二厂)；双酚A(上海化学试剂公司)；还原型辅酶Ⅰ(NADH)(中国科学院上海生物化学研究所)；氧化型辅酶Ⅱ钠盐(NADP+)(Sigma公司)；葡萄糖-6-磷酸钠盐G-6-P(中国科学院上海生物化学研究所)；雌二醇(E2)放射免疫分析试剂盒(中国原子能研究院)；睾酮(T)放射免疫分析试剂盒(北京北免东雅生物技术研究所)。
1.4 实验方法 按随机分组的原则，将小鼠分为5组，每组10只，雌雄各半。设阴性对照组(色拉油)和4个实验组。实验组BPA剂量分别为4μmol/kg、20μmol/kg、40μmol/kg、80μmol/kg。各组动物按0.8ml/100g体重腹腔注射，每日1次，连续注射3d，给药期间每日称重，根据体重变化调整给药量。第4d将动物处死。
1.5 观察指标
1.5.1 小鼠睾丸酶活性测定 取睾丸组织，去被膜，按1：5比例加入Tris/HCL缓冲液，冰浴下匀浆，4℃ 10 000r/min离心30min，取上清，紫外分光光度法测定LDH、G-6-PD活性。
1.5.2 小鼠生殖内分泌激素测定 取小鼠血清，按照雌二醇放射免疫分析试剂盒说明测定血清中E2水平。另取睾丸组织，去被膜，按1：5比例加入生理盐水，匀浆，3 500r/min离心5min，取上清液，按照睾酮放射免疫分析试剂盒说明测定睾丸组织中T水平。
1.6 统计方法 采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，计量资料均用表示，各组数据进行单因素方差分析。
2 结果
2.1 BPA对小鼠睾丸酶活性的影响 各染毒组LDH活性均明显低于阴性对照组(P<0.05)，且随着染毒剂量的增加而明显降低；G-6-PD活性4μmol/kg组较对照组明显升高(P<0.05)，其余各染毒组与对照组相比差异无显著性(P>0.05),见表1。
2.2 BPA对小鼠生殖内分泌激素的影响 雄性小鼠血清中雌二醇浓度4μmol/kg和20μmol/kg组明显低于对照组(P<0.05)，80μmol/kg组明显高于对照组(P<0.05)；雌性小鼠血清中雌二醇浓度40μmol/kg和80μmol/kg组明显高于对照组(P<0.05)。各染毒组睾丸组织中睾酮含量明显低于阴性对照组(P<0.05)，且随着染毒剂量的增加而逐渐降低，但各染毒组之间差异无显著性(P>0.05),见表1。
表1 不同剂量BPA对小鼠睾丸酶活性和内分泌激素的影响（略）
注:*与对照组比较，P<0.05。
3 讨论
近年来，环境化学物的内分泌干扰效应日益引起学术界的关注。大量调查资料表明环境中存在多种能够模拟和干扰动物及人类内分泌机能的物质，其中模拟雌激素作用的化学物最多，人们将这一大类具有雌激素样作用的化学物称为环境雌激素。它们能够模拟或干扰机体内天然雌激素的合成、分泌、转运、结合、排泄、生理作用等，从而影响生殖系统发育，破坏内分泌系统平衡［3］。双酚A是酚类化合物中有代表性的环境污染物，其类雌激素活性在国外已有报道，国内也已经有人指出其对雄性哺乳类生殖系统具有影响［4］。
3.1 BPA小鼠睾丸酶活性的影响 睾丸乳酸脱氢酶(LDH)是由生精细胞产生的，在初级精母细胞的减数分裂、分化的能量代谢过程中起着重要作用，并和生精上皮的成熟有关［5］，LDH的含量和活性的动态变化是生殖毒性的敏感指标之一。本实验中，各剂量组的BPA均能引起雄性小鼠睾丸LDH活性降低(P<0.05)，提示低剂量的BPA即可能对生精细胞造成损伤，导致LDH分泌减少或活性降低，进而阻碍生殖细胞的能量供给，逐渐导致生殖细胞变性。
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)存在于生精小管的间质细胞、支持细胞和精原细胞内，尤以间质细胞中活性最强，可作为反映间质细胞功能的指标［5］。本实验中，G-6-PD活性4μmol/kg组较对照组明显升高(P<0.05)，其余各染毒组与对照组相比差异无显著性(P>0.05)。提示可能在低剂量染毒时，生精细胞受到损伤，导致间质细胞的能量代谢活动代偿性的增强，从而使G-6-PD活性增加，用以协助恢复生精细胞功能。而当染毒剂量逐渐升高时，间质细胞也受到损伤，使其能量代谢活动受到抑制，进而使G-6-PD活性难以提高而处于停滞状态。
3.2 BPA对小鼠生殖内分泌激素的影响 雌二醇(E2)是体内生物效能最强的雌激素，雄性体内的E2主要来源于睾丸支持细胞，而雌性体内的E2是由卵巢内优势卵泡或黄体分泌而来［6］。环境雌激素BPA的结构与E2相似，都具有两个芳香环，引起雌激素活性的羟基取代位置也相同。因此，一方面BPA可以与E2竞争性结合雌激素受体(ER)，表现出雌激素拮抗作用。另一方面，BPA可与E2竞争性结合血浆性激素结合蛋白(SHBG)，虽然正常人血浆中环境雌激素与SHBG的亲和力较低，但其可置换与SHBG结合的内源性性激素，增加血浆中游离态T和E2的浓度［6］。本实验中，给予小鼠不同剂量的BPA后，雄性和雌性小鼠血清中的E2浓度逐渐升高，当染毒剂量达到80μmol/kg时，明显高于阴性对照组(P<0.05)。可能是因为当BPA浓度较高时，可与E2竞争性结合ER , 导致血浆E2浓度升高，并且高浓度的BPA与E2竞争性结合SHBG，置换与SHBG结合的内源性性激素，增加血浆中游离态E2浓度。
睾酮(T)是由位于睾丸小叶曲细精管之间的间质细胞以胆固醇为原料合成的，经支持细胞进入曲细精管后与雄激素结合蛋白(ABP)形成复合物，将T运载到精原细胞和精母细胞上，然后释放T使其进入靶细胞，促进精子发生。其次，T通过负反馈环路抑制垂体分泌间质细胞刺激素(LH)，从而参与“下丘脑－垂体－睾丸轴”中生殖激素的调节与控制。本实验中，给予小鼠不同剂量的BPA后，各染毒组睾丸组织中T含量明显低于阴性对照组(P<0.05)，且随着染毒剂量的增加而逐渐降低，说明BPA可抑制间质细胞对T的分泌。这一方面可能是因为BPA直接对睾丸间质细胞造成损伤，导致间质细胞功能下降，T分泌减少。另一方面可能是BPA通过对下丘脑－垂体－睾丸轴的影响使其分泌的促黄体激素(LH)和促卵泡激素(FSH)减少，从而影响了LH对睾丸中T合成的调节作用，使得T分泌减少。
本实验结果显示，双酚A对小鼠具有一定的生殖内分泌毒性。
【参考文献】
［1］ Sohoni P.Several environmental cestrogens are also anti-an-drogens［J］.J Endocrinol,1998,158(1):327～339.
［2］ 靳翠红，赵剑，金一和,等. 双酚A对雄性小鼠生殖系统的影响［J］.卫生毒理学杂志，2003，16(1)：39～41.
［3］ 朱毅, 舒为群, 卓鉴波,等. 双酚A 体外类雌激素活性评价及其作用机制的初步研究［J］.重庆环境科学,2003,25(4):20～22.
［4］ 张桥.小鼠精子畸形试验.卫生毒理学基础［M］.北京：人民卫生出版社，2000，249～251.
［5］ 江泉观.雄(男)性生殖毒理学［M］.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1994,225～229.
［6］ 李江源.性腺疾病［M］.天津：天津科技翻译出版公司，1997,50～59.
作者单位：吉林医药学院劳动与环境教研室，吉林 吉林 132013； 北华大学附属医院，吉林 吉林 132011.