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【摘要】 目的 探讨抗精子抗体（ASAb）与不孕不育的关系，并评价免疫荧光生物薄片技术在检测ASAb中的临床应用价值。 方法 采用间接免疫荧光法结合生物薄片技术检测1 920对不孕不育夫妇和40对正常孕期夫妇ASAb，并进行统计分析。 结果 不孕不育组ASAb阳性率明显高于正常对照组，（12.7% vs 1.25%,χ2ASAb=9.4,P＜0.01），ASAb阳性者IgG型占66.4%，IgM 型28.1%， IgA为0.6%。ASAb结合的部位分别头部占58.0%，尾部35.8%,体部3.7%,整体阳性较少为2.5%。 结论 体内抗精子抗体的存在可能是导致不孕不育的主要原因之一。生物薄片技术检测抗精子抗体特异性高，既能定性又能定位，值得在临床推广。
【关键词】 抗精子抗体 不孕不育症 生物薄片技术
Detection of anti-sperm antibody by IFA-BIOCHIP and its clinial significance.
WU Cui-ping, QIN Xi, QIAN Shi-jun.
(Affiliated Hospital of Hainan Medical College, Haikou 570102, Hainan, P. R. China)
Abstract：Objective To explore the relationship between anti-sperm antibodies and aciesis disease and evaluate the value of immunofluorescence assay (IFA) BIOCHIP in detecting anti-sperm antibodies in aciesis disease. Methods Anti-sperm antibodies in 1 920 aciesis couples and 40 normal couples were detected by indirect IFA and BIOCH IP. The results were statistically analyzed. Results The positive rate of Anti-sperm antibodies was significantly higher in the aciesis couples than that of the normal pregnant couples （12.7% vs 1.25, χ2＝9.4,P＜0.01). The positive rates of IgG, IgM, IgA were 66.4％, 28.1％, 0.6％, respectively. The combing sites of anti-sperm antibodies were head, tail and body, occupied 58.0％ 35.8％ 3.7％. But the total positive rate was only 2.5％. Conclusion The presence of anti-sperm antibodies might be the main cause leading to aciesis disease. IFA BIOCHIP is highly specific for qualitatively detecting anti-sperm antibodies and it is recommended for clinical application.
Key words：Anti-sperm antibodies; Aciesis; IFA BIOCHIP
1954年Wilson［1］在不育男性血中发现一种“精子凝集素"，后来被人证实这就是抗精子抗体(Antibodies against spermatozoa antigens，ASAb)。近年来，国内外大量研究和临床资料表明ASAb既可影响精卵结合而导致不孕，也可影响受精卵及早期胚胎的发育而致流产，抗精子抗体阳性已被列为人类免疫不孕的确定因素之一［2］。我们采用德国欧蒙医学实验诊断有限公司生产的生物薄片试剂测定1920对不孕不育夫妇和40对正常孕期夫妇血清中的ASAb，探讨ASAb与不孕不育的关系，并评价免疫荧光生物薄片技术在检测ASAb中的临床应用价值。现将结果报告如下。
1 资料和方法
1．1 研究对象 2003年5月12日～2006年11月30日就诊的1 920对不孕不育夫妇(夫妇双方同时接受检查)为不孕不育组，年龄最大48岁，最小22岁，平均为35岁。正常婚姻生活2～11年未孕或怀孕失败，男女双方均排除生殖器官器质性病变，女性无性激素异常、无甲状腺功能亢进或低下及糖尿病等内分泌疾病;选取健康孕期夫妇40对（孕龄12～25W）为对照组，年龄23～35岁，平均年龄29岁。无自然流产史。男女双方空腹抽取静脉血4ml左右，离心后分离出血清，存入4℃冰箱待测。
1．2 检测方法 生物薄片试剂盒由德国欧蒙医学实验诊断有限公司提供。实验严格按照操作说明书进行。取配套加样板，按顺序分别滴加1:32稀释的待测血清及阳性、阴性对照血清25μl至加样板的反应区中,盖上已包被人类完整精子的生物薄片，反应30min；PBS洗涤3次，置PBS中浸泡5min;滴加20μl FITC标记的抗人免疫球蛋白于洁净加样板的反应区中,从PBS缓冲液中取出薄片盖上，避光反应30min; PBS洗涤3次，置PBS中浸泡5min；取出后滴加10μl甘油/PBS封片。在OLYMPUS荧光显微镜下观察结果。
1．3 统计学处理 分别统计各组受检者的阳性率，各类型抗体阳性率及抗体结合部位的分布，采用χ2检验比较其差异性。
2 结果
2．1 不孕不育组与正常对照组ASAb检测结果比较 不孕不育组ASAb阳性率12.7%(488/3 840)明显高于正常对照组阳性率1.25(1/80) ,两者比较差异有显著性（χ2＝9.4,P＜0.01）。见表1。
2.2 不孕不育男女受检者ASAb阳性率比较 检测1 920对不孕夫妇ASAb，男性阳性率14.2%(272/1 920),女性阳性数11.3%(216/1 920)，两者之间差异有显著性（χ2＝7.4，P＜0.01）。见表2。
表1 不孕不育组与对照组ASAb的检测结果（略）
注:*与对照组比较, χ2ASAb=9.4,P＜0.01。
表2 不孕不育男女受检者抗精子抗体阳性率的比较（略）
注:男女患者比较, χ2ASAb=7.4,P＜0.01。
2．3 ASAb阳性标本抗体类型分布 488例ASAb阳性患者中，各类型抗体阳性率分别为IgG 66.4%(324/488)、IgM 28.1%(137/488)、IgA 0.6%(3/488), IgG+IgM 4.9%(24/488)。显示ASAb阳性以IgG为主，IgM次之，分泌型IgA最少。
2.4 ASAb阳性标本中抗体结合部位分布 488例ASAb阳性标本中，ASAb头部阳性率58.0%（283/488），尾部阳性率35.8%(175/488)，体部阳性率3.7%(18/488)，头部＋体部＋尾部阳性率2.5%(12/488)。结果显示ASAb以结合头部为主，尾部阳性次之，整条阳性较少。
3 讨论
正常生理状态下，由于血睾屏障的作用，使精子与自身免疫系统隔离，男性不产生ASAb，同时正常精液具有免疫抑制作用，可抑制女方免疫活性细胞针对精子抗原的免疫应答，也不会产生ASAb。当炎症、阻塞、免疫系统遭到破坏等病理情况下,可导致自身或同种ASAb的产生。大量研究和临床资料表明［3］，10%～30％的免疫性不孕不育由于ASAb引起。本研究结果显示不孕不育患者ASAb阳性率12.7%(488/3 840),明显高于正常对照组（1.25%），两组比较差异有显著性（χ2＝9.4,P＜0.01），男性阳性率（14.2 %）高于女性（11.3%）。ASAb 干扰生育的机制［4,5］如下：①抗精子头部的抗体可干扰精子获能及头粒反应；②在补体参与下使精子膜损伤，精子死亡；③ASAb的Fc段与宫颈粘液糖蛋白结合，干扰精子穿过排卵期宫颈粘液；④增强生殖道局部吞噬细胞对精子的吞噬作用；⑤阻止精子与透明带及卵细胞膜结合，抑制受精。
有作者指出［6,7］检测ASAb类型及其抗体结合部位可为不孕不育的诊断和治疗提供有意义的资料。各类型抗精子抗体中，IgM-AsAb与生殖关系不大，生殖道局部的IgA-ASAb、IgG-ASAb在局部循环免疫中起重要作用，而循环的IgG-ASAb既可参与局部免疫影响精卵结合，亦可影响受精卵及胚胎的发育而致流产。同时ASAb与精子结合的部位也决定了它对生育的损害程度，结合于精子头部的ASAb对生育损害最大，可干扰精子获能及头粒反应，并能阻止精子与透明带及卵细胞的结合，抑制受精；结合于体部的抗体能抑制精子活动而结合于精子尾部的抗体与生育无关［8］。因此检测ASAb理想的方法应该是既可能确定抗体类型，又可判断抗体在精子上的结合部位，目前ASAb的检测大多采用ELISA法，只能定性检测ASAb，但不能确定抗体的结合部位。我们采用免疫荧光生物薄片技术，该方法通过包被人的完整精子于薄片上作为抗原基质与患者血清反应，如果阳性，加入标记FITC的抗人免疫球蛋白，既可在荧光显微镜下判断抗体类型，又可清楚地看到精子上抗体结合部位发出的荧光。实验结果表明，在ASAb阳性的患者中主要以IgG为主为66.4%，IgM次之为28.1%，IgG和IgM同时阳性的为4,9，分泌型IgA 极少仅为 0.6%。精子头部的ASAb阳性率最高为58.0%，尾部阳性率为35.8%，体部阳性率3.7%，整条精子阳性率为2.5%。所以ASAb阳性的患者同时进行抗体分型和确定ASAb结合的具体部位，可以为临床诊断和治疗提供有意义的依据。
本研究采用免疫荧光生物薄抗片技术检测ASAb，该法将人类完整精子包被于反应板，再加入单抗隆二抗，因此能够检测到特异的ASAb。目前国内外的报道大多采用的ELISA法，是将精子膜包被于反应板，加待测标本孵育后再加酶标二抗，使底物显色，用酶标仪判定结果。其阳性率多在12.5%～40%之间［9］，高于我们用免疫荧光生物薄片技术检测出来的阳性率。我们认为，免疫荧光生物薄片技术与ELISA法对精子抗原的取材不同，所用二抗不同，从而造成两种方法检测的结果差异较大。荧光免疫生物薄片法所采用的二抗是单克隆抗体，故检测的特异性高于ELISA。ELISA法影响因素多，且在用ELISA方法的酶标记抗体作Ig分类检测时，不能排除类风湿因子的干扰。
ASAb阳性是引起不孕不育的重要因素之一。免疫荧光生物薄片技术检测ASAb特异性高，既能定性又能定位，在免疫性不孕不育的诊断和治疗中具有很大的临床应用价值。
【参考文献】
［1］ Dondero F,Grandini L,Lombardo F,et al.Antisperm antibody detection:1.Methods and standard protocol［J］.Am J Reprod Immunol,1997,38:218.
［2］ 世界卫生组织编,北京协和医院和国家计划生育委员会科学技术所译［J］.不育夫妇标准检查与诊断手册,1994,1:4.
［3］ Adeghe JHMale subfertility dueto sperm antibodies［J］.Obstet Gynecol Surv,1992,48(1):1～8.
［4］ Tumg K S K,Okada A,Yanagimachi R. Sperm auto-antigens and fertiliza-tion l.Effects of antibodies on rouleaux formation.Viability and acrosome reactive of guinea pig sperm［J］.Biol Repro,1980,23:877.
［5］ 高绍兴.抗精子抗体对男子生育有何影响［J］.中国男科学杂志，2000，14（1）：61.
［6］ 学诗，寥宝平.用免疫珠实验检查312例不孕患者抗精子抗体的临床分析［J］.中国优生与遗传杂志，2000，8（2）：109～110.
［7］ 林景涛，代艳杰，王志峰.精子抗体酶免定量分析检测［J］.临床检验杂志，2000，18（4）：219.
［8］ Zouari R,er al. Localization of antibodies on spermatozoa and sperm movement characteristics are good predictors of in vitro fertilization［J］. Fertil Steril, 1993, 59(3): 606.
［9］ 施云飞，毛拥军.不育症患者抗精子抗体检测及其临床评价［J］.男性学杂志，1995，9（2）：117～119.
作者单位：海南医学院附属医院，海南 海口 570102.