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【摘要】 目的 研究血管紧张素原（AGT）基因四个位点的单核苷酸多态及其构成的单倍型与海南黎族原发性高血压并脑梗死的相关性。 方法 选择海南黎族人群为研究对象，利用PCR-直接测序法，在100例原发性高血压并脑梗死患者和100例健康对照者中，对AGT基因启动子区域的G-152A，A-20C，C -18T，A-6G多态进行基因分型。 结果 原发性高血压并脑梗死组与健康对照组相比，C -18T多态的基因型和等位基因频率分布差异均有显著性（P=0.002，P=0.002）。A-6G多态的G等位基因频率在原发性高血压并脑梗死组显著高于对照组（P=0.016）。单倍型分析提示由-20C和-6G构成的H6单倍型在原发性高血压并脑梗死组中明显增加，与对照组相比有显著性差异（P=0.003）。 结论 在海南黎族人群中，A-20C，C -18T，A-6G多态可能是原发性高血压并脑梗死发病的遗传危险因素。
【关键词】 血管紧张素原基因 原发性高血压并脑梗死 单核苷酸多态 单倍型
Relationship between aniotersinogen gene polymorphism and primary hypertension complicated with cerebral infarction in Hainan Li ethnic groups.
WANG Tan, CHEN Zhi-bin, JIN Shui-jing, et al.
(Affiliated Hospital of Hainan Medical College, Haikou 570102, Hainan, P. R. China)
Abstract：Objective To analyze the relationship between four single nucleotide polymorphisms (SNPs) and their haplotypes of angiotensinogen (AGT) Gene and primary hypertension complicated with cerebral infarction in Li ethnic groups of Hainan Province. Methods The genotypes in 100 primary hypertension patients complicated with cerebral infarction and 100 healthy controls were determined by the method of PCR-sequencing using four AGT gene polymorphisms at position -152(G/A),-20(A/G),-18(C/T) and -6(A/G) in the promoter region. Results The frequencies of CT genotype of AGT -18 and T allele were significantly higher in primary hypertension patients complicated with cerebral infarction than that of healthy controls. The frequencies of G allele of AGT -6 was significantly higher in essential hypertension complicated with cerebral infarction than that of healthy controls. Haplotype analysis revealed that H6 Haplotype frequency, which included -20C and 6G, was significantly increased in the group of primary hypertension patients complicated with cerebral infarction（P=0.003）. Conclusion A-20C，C-18T，A-6G might be genetic risk factors for primary hypertension patients complicated with cerebral infarction in Hainan Li ethnic groups.
Key words：Angiotensinogen gene; Primary hypertension complicated with cerebral infarction; Single nucleotide polymorphism; Haplotype
我国近年来对各民族的血管紧张素原基因多态性与原发性高血压的关系作了大量研究。该基因的单核苷酸多态性（SNP）位点存在种族和个体的差异，并可导致对疾病不同的易感性［1］。本研究旨在探讨AGT基因启动子区G-152A，A-20C，C -18T，A-6G多态性与海南黎族原发性高血压合并脑梗死的关系，以了解AGT基因在该民族脑血管疾病发病中的作用。
1 对象和方法
1.1 研究对象 所有研究对象为海南乐东和昌江两县世居黎族人，随机选取2005年7月～2006年9月在海南乐东、昌江两地县医院病房和门诊的患者及健康人群。病例组根据1999年WHO的高血压病的诊断标准：收缩压≥140mmHg和（或）舒张压≥90mmHg，以在3个不同时间安静状态下测量血压值的平均值为准。同时符合全国第四届脑血管疾病会议诊断标准，经临床、头颅CT（和/或MRI）确诊为脑梗死者(100例，男52例，女48例)，年龄(54.16±11.09)岁，排除继发性高血压、严重肝肾功能障碍及甲状腺疾病患者。对照组为乐东、昌江两地县医院门诊行常规体检，排除心脑血管疾病、糖尿病、肝肾功能不全及无高血压家族史的健康者(100例，男50例，女50例)，年龄(52.68±10.87)岁。
1.2 基因组DNA提取 采集外周静脉血5ml，3.8%枸橼酸钠1：6抗凝，经酚/氯仿法抽提白细胞中的基因组DNA，溶于TE。
1.3 AGT基因启动子区域各单核苷酸多态的检测 PCR引物由北京擎科生物技术公司合成。PCR引物序列分别为：5’-CCCTGCACCGGCTCACTCTG-3’和PCR-R：5’-GCAGGAAGACCAGACCATCT-3’。
1.4 统计学方法 病例组与对照组SNP基因型的Hardy-Weinberg 平衡定律吻合度、两组间座位连锁不平衡参数D'、多态性分布是否呈连锁不平衡（linkage disequilibrium，LD）采用SHEsis软件分析［2］。利用χ2 检验病例组与对照组等位基因和基因型频率分布的差异。
2 结果
2.1 原发性高血压并脑梗死组与健康志愿对照组的临床资料比较 原发性高血压并脑梗死组与对照组年龄与性别构成无显著性差异（P=0.342，P=0.591）。在BMI指数、高血压病史及家族史等方面病例组高于对照组（P<0.05）。见表1。
表1 原发性高血压并脑梗死单危险因素Logistic回归结果（略）
2.2 配对连锁不平衡分析 AGT基因启动子区4个位点的配对连锁不平衡分析用连锁不平衡统计量D'表示（见表2）。设定连锁不平衡分析水平为单体型频率≥3%，应用SHEsis软件分析连锁不平衡参数，在所有6个配对组合中-20A/C和-18C/T位点，-20A/C和-6A/G位点间未见有意义的连锁不平衡（D'<0.05），其余4个配对都检测到绝对的连锁不平衡（D'=1.0）。
表2 AGT基因多态间配对连锁不平衡（D'）和统计学意义（略）
2.3 AGT基因4个位点各单核苷酸多态在原发性高血压并脑梗死组与健康对照组的分布 对AGT基因4个位点的分析结果见（表3）。G -152A多态的基因型（AA、AG和GG）及A、G等位基因频率病例组与对照组比较无显著性差异（分别为χ2=2.407，P=0.121；χ2=2.260，P=0.133）。A -20C多态的基因型（CC、AC、和AA）及C、A等位基因频率病例组与对照组比较无显著性差异（分别为χ2=0.328，P=0.848；χ2=0.237，P=0.626）。C-18T 多态的基因型（TT、CT、和CC）及T、C等位基因频率病例组与对照组比较有显著性差异（分别为χ2=9.783，P=0.002；χ2=9.375，P=0.002）。A-6G多态的基因型（GG、GA、和AA）病例组与对照组比较无显著性差异（χ2=5.201，P=0.074）；G、A等位基因频率病例组与对照组比较有显著性差异（χ2=5.699，P=0.016）。
表3 AGT基因四种单核苷酸多态位点基因型和等位基因频率在病例组和对照组中的分布（略）
2.4 AGT基因启动子区4个位点单核苷酸多态构成的单倍型分布 采用SHEsis软件分析提示启动子区域的G -152A、A -20C、C-18T、A-6G多态位于同一个单倍域，并构成了6种单倍型。最常见的单倍型为H1：G-A-C-A(71.5%)，其次为H2：G-C-C-A(14.0%)，两者间的区别在于A -20C的差异。其中-152G，-20C，-18C和-6G等位基因构成的H6单倍型及-152G，-20A，-18T和-6A等位基因构成的H5单倍型频率在病例组中明显升高，与对照组相比有显著性差异（分别为13/2，χ2=8.578，P=0.003；12/2，χ2=7.402，P=0.006）（表4）。其余4种单倍型频率在病例组和对照组中相比均无显著性差异（P>0.05）。
表4 AGT基因单倍型在病例组和对照组中的分布（略）
注：从左至右分别代表G-152A、A-20C、C-18T、A-6G多态，左侧等位基因用0表示，右侧的用1表示。
3 讨论
脑梗死属复杂性疾病，这类复杂的多基因病是由遗传因素和环境条件共同决定的，遗传因素较环境因素其意义可能更重要，因此许多研究者致力于脑梗死与基因多态性相关性的探索。迄今为止最大的一项荟萃分析（51项研究，100万人）结果表明，收缩压和舒张压是脑卒中的独立预测因子，脉压对其影响在55岁以后将有所增加［3］。因此研究原发性高血压合并脑梗死的发病因素尤为重要。
RAS系统在原发性高血压发生中的意义人们已达成共识，AGT是RAS系统仅知的天然肾素底物，因此有关它的研究一直受到重视。上游核心启动子区域（AGCE1）对AGTmRNA的转录是必要的，AGT基因AGCE1可能通过调控AGT基因表达和循环中AGT水平来调节血压［4］，Inoue等［5］在实验中发现，AGCE1的G-6A突变可以使AGT基因基础转录速率增加30%～70%。
目前关于脑梗死的遗传学特征知之甚少。有研究提示中国人群AGT基因235TT多态性与脑卒中的发病呈明显正相关，AGT基因M235T多态可能是中国汉族人群原发性高血压合并脑梗死的遗传危险因素［6］。我们首次在黎族人群中进行了AGT基因启动子区域G-152A、A-20C、C-18T、A-6G多态及其构成的单倍型与原发性高血压并脑梗死患者的相关性分析。病例组与对照组G-152A、A-20C、C-18T、A-6G基因型频率分布均符合H-W平衡P值均〉0.05，说明上述基因来自于同一群体已达到遗传平衡，具有群体代表性。配对连锁不平衡分析发现，G-152A与A-20C、C-18T、 A-6G和C-18T与A-6G均存在绝对的连锁不平衡，可能这些位点在进化过程中来自同一祖先，且未发生重组，很可能是进化上比较年轻的片段。C-18T，A-6G和A-20C未见连锁不平衡，可能这几个多态是较古老的多态，在其他多态产生之前就已经存在了。
目前对于AGT-18位点的研究结果不尽相同：对哈萨克族人AGT基因变异的研究发现不存在C-18T变异［7］，Sato等［8］对日本人的研究发现C-18T变异的CC基因型的频率在高血压明显增高，认为该变异与高血压有关。而在我们的研究中表明，TT、CT、CC基因型及T、C等位基因频率在健康对照组和病例组之间差异均存在显著性。提示（-18）C-T变异可能与黎族人群的原发性高血压并脑梗死有关。C-18T变异的CT基因型的频率在原发性高血压患者中明显增高，上述不一致的结果提示不同人群存在的基因变异不同。（-6）位点G、A等位基因频率在健康对照组和病例组之间有显著性差异，提示（-6）位点携带G等位基因可能增加了原发性高血压并脑梗死的发病危险。本研究结果与此结论不一致。我们认为AGT启动子区基因多态性是导致黎族原发性高血压并脑梗死的可能原因之一。
对于复杂疾病，个体中单倍型的传递有时比单个位点的传递更有效［9］，因此将多个单核苷酸多态性（SNP）组合分析比单位点分析更具有遗传学意义。进行单倍型分析发现，4个多态位点组成的单倍型分布在6种单倍型中，研究发现由G-C-C-G等位基因构成的H6单倍型及G-A-T-A等位基因构成的H5单倍型频率在病例组中明显升高，与对照组相比有显著性差异，提示H6及H5单倍型可能与原发性高血压并脑梗死的发生相关。我们可以看出H5中存在-18T的变异，其余位点均为未变异基因。而从单个位点单核苷酸多态性分析可以发现（-18）C-T变异可能与黎族人群的原发性高血压并脑梗死的发生相关联，所以推测H5单倍型可能是由于（-18）C-T变异而导致了原发性高血压并脑梗死的发生，-152，-20及-6位点的等位基因对其影响不大。H6由-20C和-6G等位基因构成，推测可能是多态之间的协同作用，通过影响AGT基因的转录活性，改变血浆AGT浓度，通过改变局部的肾素-血管紧张素系统活性，同时引起局部脑组织AGT表达的改变而发挥作用。H6单倍型可能为黎族人群原发性高血压并脑梗死发病的重要遗传因素。
总之，本次研究结果表明，AGT基因5′端核心启动子区域（-18）C-T变异可能与黎族人群的原发性高血压并脑梗死易感性有关，是导致其原发性高血压并脑梗死的可能原因之一；（-6）位点携带G等位基因可能增加了原发性高血压并脑梗死的发病危险。单倍型H6（-20C和-6G）可能为黎族人群原发性高血压并脑梗死发病的重要遗传因素。
【参考文献】
［1］ 刘天承，侯淑琴，张琳,等.汉族人群血管紧张素原基因的新单核苷酸多态性位点［J］.基础医学与临床,2002,22(3):219～222.
［2］ Shi YY, He L. SHEsis, a powerful software platform for analyses of linkage disequilibrium, haplotype construction, and genetic association at polymorphism loci［J］. Cell Res, 2005,15:97～98.
［3］ Prospective studies Collaboration. Age-specific relevance of usual blood pressure to rascular mortality: a meta-analysis of individual data for one million adults in 61 prospective studies［J］. Lancet, 2002,360:1903～1931.
［4］ Yang GY, Nibu Y, Murakani K, et al. A cis-acting DNA element located between TATA box and transcription in ititation site is critical in response to regulatory sequences in human angiotensinogen gene［J］. The Joumal of Biolocial Chemistry,1996,271:15981～15989.
［5］ Inoue J, Nakajima T, Williams CS, et al. A nucleotide substitution in the promoter of human angiotensinogen is associated with essential hypertension and affects basal transcription in vitra［J］. J Clin Invest,1997, 99:1786～1792.
［6］ 张剑平，王滨，程卫国,等.血管紧张素原基因多态与原发性高血压合并脑梗死的相关性［J］.中国临床医学，2005，12（6）：1132～1133.
［7］ 李南方，周玲，吴卫东,等. 血管紧张素原基因5′端核心启动子区(-6)A-G和(-20)A-C变异与哈萨克族人原发性高血压相关相关性分析［J］.中华医学遗传学杂志,2004,21(1):23～28.
［8］ Sato N, Katsuya T, Rakugi H, et al. Association of variants in critical core promoter element of angiotensinogen gene with increased risk of essential hypertension in Japanese［J］. Hypertension, 1997,30:321～325.
［9］ Fallin D, Cohen A, Essioux L, Chumakov I, Blumenfeld M, Cohen D, Schork N J. Genetic Analysis of Case/Control Data Using Estimated Haplotype Frequencies: Application to APOE Locus Variationand Alzheimer's Disease［J］. Genome Research, 2001,11:143～151.
作者单位：海南医学院附属医院,海南 海口 570102; 海南省干部疗养院,海南 海口 571100.