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【摘要】 目的 筛选新的日本血吸虫（Schistosoma japonicum, Sj）候选抗原基因。 方法 以Sj 雄虫成虫DNA为模板，设计引物扩增并纯化特异性片段，构建pBS-T克隆载体，将其克隆入大肠杆菌DH5α菌株，筛选阳性克隆，初步进行菌落PCR鉴定后测序，与EBI数据库中的已知序列比对分析，并用蛋白质分析软件预测其结构与功能。 结果 利用日本血吸虫cDNA序列设计并合成引物，以Sj雄虫DNA为模板，成功地扩增和克隆出一个目的基因。通过菌落PCR检验和测序，BLAST比对分析显示其与日本血吸虫22.6 kDa抗原分子具有很高同源性，氨基酸预测分析其具有潜在螺旋跨膜和酪氨酸激酶磷酸化位点。 结论 成功克隆一个目的基因，通过氨基酸预测和功能分析，预测其在血吸虫病免疫防治领域具有一定的意义。
【关键词】 日本血吸虫 抗原基因 克隆 序列分析 基因功能预测
Acquisition and bioinformatics of analysis of gene encoding antigen for vaccine against adult S.japonicum.
LU Yin-zhong, MA Yu-dong, CHEN Si-li.
(College of Life Science, Zhongnan Nationality University, Wuhan 430074, P. R. China)
Abstract：Objective To screen a new effective gene of candidate vaccine against Schistosoma japonicum. Methods The template of male S.japonicum DNA and the designed primers were used to amplify the specific fragment, which was purified and cloned to the E.coli DH 5α.The inserts of the positive clones were identified firstly by PCR and further sequenced, and data were analyzed by internet Nucleotide BLAST software of EBI and Expert Protein Analysis System of Swiss Institute of Bioinformatics. Results A gene fragment was successfully cloned and the structure of nucleic acid and function was predicted. Conclusion Further study in screening and identifying some schistosomal genes encoding candidate antigens for vaccines against Schistosoma japonicum be conducted.
Key words：Schistosoma japonicum; Gene encoding antigen; Clone; Sequencing; Bioinformatics analysis
寻找新的有效的疫苗候选基因是当前血吸虫病防治研究的重点，免疫防治是控制血吸虫病的有效途径［1］。本文利用日本血吸虫cDNA序列设计并合成引物，克隆目的基因，旨在获取新的成虫抗原基因。现将结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 虫株 S.japonicum成虫由湖北省预防医学科学院血吸虫病防治研究所惠赠。
1.1.2 菌株、载体与主要试剂 菌株E.coli DH5α,由中南民族大学生物工程实验中心保存，可以在液体和固体SOB培养基中生长。载体pBS-T连接试剂盒，购自TIANGENE 公司。 Taq酶，dNTP 购自大连宝申公司，琼脂糖为Amerso 分装，其它试剂为国产分析纯。PCR引物由上海Invitrogen公司合成。
1.1.3 主要仪器 离心机为SIGMA公司产品 ，PCR扩增仪为Biometra 型，JS-380A自动凝胶图像分析仪为上海培清科学有限公司产品。
1．2 方法
1.2.1 总DNA的提取与鉴定 PBS缓冲液浸泡S.j成虫，充分匀浆，用蛋白酶K消化，采用酚法抽提DNA，无水乙醇沉淀离心。加入TE和Rnase处理，用琼脂糖凝胶电泳检测其纯度及质量。
1.2.2 DH5α感受态细胞的制备 参照文献［2］进行，制备完加入等体积的60%甘油混匀，放入-70℃冰箱中冷冻贮存，备用。
1.2.3 聚合酶链式反应 根据cDNA序列（ GenBank 登录号：CX535759），设计一对引物：P1：5'-CGCTCTTACTTCATCACCAG-3’,P2：5'-ACTTCCCAAACCTTTAGACC-3’，以日本血吸虫雄虫总DNA为模板进行扩增。循环参数为：94℃ 预变性4min,94℃ 变性30s、42℃ 退火1min、72℃ 延伸1min,共35个循环,末次循环后72℃保温10min,4℃终止反应。琼脂糖凝胶电泳于凝胶成像系统下观察分析PCR产物。
1.2.4 基因片段的克隆及阳性克隆的鉴定 PCR扩增产物按文献［3］纯化后用于目的片段的连接，方法参考TIANGEN 公司pBS-T克隆试剂盒说明书及［2］相关内容进行。经蓝白斑筛选，挑取单个白色菌落,置SOC液体培养基(含Amp)中振荡培养过夜。取约200μL培养菌液，按参考文献［4］作PCR鉴定。PCR体系及相关程序与扩增目的片段相同。
1.2.5 基因片段的序列测定和分析 将含pBS-T重组质粒的菌液送上海Invitrogen公司以通用引物T7(TAA TAG GAC TCA CTA TAG GG )和T3（ATT AAC CCT CAC TAA AGG GAA）进行序列测定。运用BLAST程序,将测序结果及其推导所编码的氨基酸序列与EBI数据库在核苷酸水平和氨基酸水平进行同源性比较；根据score 值确定序列片段是已知还是未知新基因。
2 结果
2.1 总DNA的提取与鉴定 按照酚法抽提S.japonicum总DNA，2.0%琼脂糖凝胶电泳检测于凝胶成像系统下观察其纯度与含量，与理论相符，纯度及含量可用作PCR模板。
2.2 基因的扩增 利用引物P1和P2从Sj 总DNA中扩增出基因片段，产物经2.0% 琼脂糖电泳显示，在500～750bpbp 处有一特异性扩增条带（见图1），在600bp大小，结果提示基因扩增成功。
图1 PCR产物2％琼脂糖凝胶电泳分析（略）
1:ddH2O ; 2，3: DNA PCR产物; M: DNA分子质量标准(DL2000)
Fig 1 Agarose gel electrophoresis for DNA PCR products
M: Standard DNA marker(DL2000); 1: ddH2O; 2，3:DNA PCR products
2.3 菌落PCR鉴定阳性克隆子 将白斑重组子与总DNA同时作PCR 鉴定，产物经2.0%琼脂糖电泳（如图2）分析显示，以重组质粒和总DNA为模板在同一处扩增出带，且大小与目的片段一致，可以确定阳性克隆子筛选成功。
图2 PCR鉴定阳性克隆的琼脂糖凝胶电泳（略）
1: ddH2O; 2,3: Sj DNA; 4～8:阳性克隆 PCR产物; M: DNA分子质量标准（DL2000）
Fig 2 Agarose gel electrophoresis for PCR identification of positive clones
1: water ; 2,3: S.japonicum total DNA; 4～8: Positive clone PCR products; M: Standard DNA marker (DL2000)
2.4 基因序列的测定 对克隆基因进行核苷酸序列测定，克隆的基因片段长636 bp，编码 63 个氨基酸残基，结果见图3。
图3 克隆基因序列及其所编码的氨基酸（略）
Fig 3 The nucleotide and deduced amino acids sequence of clone gene
2.5 基因序列分析 利用EMBL-EBI 的Parasite blast及UniProt Knowledgebase对已知的克隆基因序列和推断的氨基酸作同源性分析，结果分别见表1～2。氨基酸预测分析其在25～33位具有一个包含9个氨基酸残基的潜在螺旋跨膜片段和在38～39位有一个剪切位点。此外还有一个酪氨酸激酶磷酸化位点。
表1 克隆基因与部分血吸虫基因比对分析结果（略）
Table 1 Database match of clone Gene to Schistosoma japonicum
表2 克隆基因编码氨基酸与蛋白质数据据比对分析（略）
Table 2 Database match of clone Gene coding amino acids to Schistosoma japonicum
3 讨论
目前获取日本血吸虫抗原基因的途径主要有两条：一是从基因组文库中筛选。二是根据已掌握的抗原和抗原基因信息利用分子生物学技术及生物信息学方法人工合成侯选抗原的目的基因。这是获得抗原目的基因最常用的方法［5］。国内外曼氏血吸虫的研究工作对日本血吸虫抗原和抗原基因的筛选获得及分析研究等方面均产生了重要的影响，例如利用曼氏血吸虫已筛选出的抗原和抗原基因进行对比筛选日本血吸虫的抗原和抗原基因等。虽然目前血吸虫疫苗的研究已经取得了一些进展，获取了如GST、TPI、FABP、GAPDH、副肌球蛋白、22.6膜相关抗原和组织蛋白酶B等候选疫苗分子，但是只能提供部分保护作用［6～9］。
本研究通过引物设计，从cDNA 文库中钓取目的基因，获取了一个基因片段，找到一个部分编码框，经BLAST同源性比对分析，其与日本血吸虫22.6 kDa膜相关抗原、22.6 kDa表皮抗原、22.6 kDa体表膜相关抗原，分子具有很高同源性，其Score 值分别为913、911、882。氨基酸预测分析：在25～33位具有一个包含9个氨基酸残基的潜在螺旋跨膜片段、38～39位的一个剪切位点和一个酪氨酸激酶磷酸化位点。推测跨膜片段和剪切位点对于正常功能的行使有重要的作用。
虽然在本研究中未能从文库中找出一个完整的编码基因，但是获取的部分编码区结构与功能，但通过生物信息学技术预测相关基因及蛋白的结构与功能，揭示其在25～33位有一个包含9个氨基酸残基的潜在螺旋跨膜片段和在38～39位有一个剪切位点，还有一个酪氨酸激酶磷酸化位点。这将为进一步设计和改造疫苗分子提供十分诱人的前景［10］。
【参考文献】
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作者单位：中南民族大学 生命科学学院，湖北 武汉 430074.