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【摘要】 目的 探讨罗非鱼片加工下脚料提取液化蛋白的工艺，为有效利用罗非鱼片加工下脚料中的蛋白质提供科学依据。 方法 使用不同的蛋白酶和不同的工艺对罗非鱼片下脚料的蛋白质进行水解，通过测定其水解率进行优选。 结果 采用复合酶，在温度50℃，pH7，酶解6h，水解得率最高。 结论 复合酶法用于罗非鱼下脚料制取液化蛋白，生产工艺简单、周期短。并显示液化蛋白质营养丰富，含有大量鲜氨基酸, 具有良好的开发价值和广阔的市场前景。
【关键词】 罗非鱼 下脚料 蛋白酶 液化蛋白
Study on extracting liquefied protein from the waste of offal of Tilapia with enzyme.
YI Mei-hua, WANG Bin, LIU Shi-sheng, et al.
(Hainan University, Haikou 570208, Hainan, P. R. China)
Abstract：Objective To optimize the technology in extracting liquefied protein from the offal of Tilapia. Methods The offal protein was hydrolyzed with different enzymes under different conditions, with the hydrolysis rate as index. Results Hydrolysis rate was the highest with the complex enzyme under 50℃ at pH7 for 6h. Conclusion The technology in extraction of liquefied protein from the offal of Tilapia with complex enzyme is simple and fast. The extracted protein product contains large quantity of amino acid and there is a bright prospect for explotation and maketing.
Key words：Tilapia; Offal; Protease; Liquidized protein
罗非鱼（Tilapia）属鲈形目，鲈亚目，丽鱼科，罗非鱼属。该鱼原产于非洲大陆，是热带性鱼类。具有生长快，耐低氧，广盐性，病害少，易繁殖，肉质好，产量高等优点［1］。适合在淡水或咸淡水的池塘、网箱、水槽、流水池、循环池系统等各种水体中生长［2］。为繁殖最快的世界性鱼类之一，并已引起世界各国养殖者的重视，其产量在世界上仅次于鲤鱼，居第二位［1］。据FAO统计，目前世界上有85个国家和地区养殖罗非鱼，产量已达120万吨。我国养殖罗非鱼，至今已有40多年历史。2001年产量为69万吨，占世界总产量的58%［3］。目前，广东、海南、广西、福建等地等地都形成了迅猛发展的罗非鱼产业。罗非鱼是继三文鱼和对虾之后拥有国际市场的养殖水产品。其身价已从60～70年代联合国粮农组织（FAO）推广的可为贫穷农、渔民解决蛋白源和脱贫的“穷人的鱼”，转变为可替代逐年短缺的鳕鱼等海洋优质鱼的“白色三文鱼”，越来越为发达国家中产阶层所青睐。2005年海南省罗非鱼养殖面积19万亩，产量15万吨。全省有水产加工厂32家，加工的冷冻罗非鱼片大多出口美国、加拿大、欧盟、日本等地。
罗非鱼冷冻鱼片在加工过程中会产生大量的下脚料（包括鱼头、鱼皮、鱼鳍、鱼尾、鱼骨及其残留鱼肉），其重量约占原料鱼的40%～55%［4］。 如果不进行有效处理，不仅会浪费大量的食品资源，而且对环境造成污染，为此，对其下脚料进行高效综合利用，可提高罗非鱼加工的附加值，获得良好的经济和社会效益。液化蛋白即水溶性的蛋白质，易于消化吸收，是人类及动物的良好营养补充剂，可作为蛋白质和氨基酸的强化剂应用于营养保健品，也适用于高档调味品和汤料，具有广泛的应用价值。
1 材料与方法
1.1 材料 罗非鱼片加工下脚料由海南泉溢食品有限公司提供；细菌蛋白酶EY3、动、植物蛋白酶EY4、EY5分别来自无锡杰能科生物有限公司。
1.2 主要检测项目与方法 氨基酸态氮的测定以GB/T5009.39；可溶性蛋白的测定以双缩脲法［7］；水解率(DH)的测定；水分的测定以GB/T5009.3；脂肪的测定以GB/T5009.6；粗蛋白的测定以GB/T5009.5；氨基酸组成的检测以GB/T5009；挥发性盐基氮的测定以半微量凯氏定氮法［7］；水解液中可溶性蛋白/总蛋白×100%。
1.3 实验工艺路线
罗非鱼→切片→下脚料→去内脏→残余部分→捣碎→酶解→分离→液化蛋白
↓骨、渣
2 结果
2.1 罗非鱼下脚料主要成分的测定 对罗非鱼下脚料的主要成分水分、粗蛋白、脂肪、挥发性盐基氮进行了检测，结果显示，新鲜罗非鱼下脚料挥发性盐基氮为3.65(mg/100g)，粗蛋白质与粗脂肪都比较高，分别为12.6%与16.95%，水份为63.13%。
2.2 同一种酶不同的反应条件对蛋白质水解率的影响
2.2.1 液固比的影响 选择了不同液固比进行水解，经过实验表明，液固比小时，底物浓度过高，分散不均匀，过多底物分子堆集于酶的活动中心，从而会影响催化速度及产物分子的扩散，故水解率较低；液固比过大，一方面虽然使底物分散更均匀，溶解度增加，溶液中相对可溶性蛋白质含量低，给以后的浓缩等带来麻烦，因此取3：1为宜［6］。
2.2.2 时间的影响 选用不同的时间，梯度分别为1h、3h、5h、7h、9h，pH自然，选用的酶分别为EY3、EY4、EY5，在液固比为3：1，温度为50℃，加酶量为原料重的万分之四的条件下酶解，以水解率为纵坐标，时间为横坐标，结果如图1所示。
图1 时间对水解率的影响（略）
由图1可看出，罗非鱼下脚料蛋白质的水解率随着酶解时间的延长而增加，在9h达到最理想的水解率，9h以后，水解率逐步下降。
2.2.3 pH值的影响 选用不同的pH值，分别为6、7、8，选用的酶分别为EY3、EY4、EY5，液固比为3：1，温度53℃，加酶量为原料重万分之四的条件下，酶解3h，结果如图2所示。
图2 酶解pH对蛋白质水解率的影响（略）
由图2可知，当pH为8时EY3酶、EY4酶和EY5酶的蛋白质水解率都发挥得比较好，EY5酶的蛋白质水解率在pH6-8时相差不明显。
2.2.4 温度的影响 选用不同的温度，分别为45℃、50℃和55℃，pH7，选用的酶分别为EY3，EY4，EY5，在液固比为3：1，加酶量为原料重万分之四的条件下，酶解3h，结果如图3所示。
图3 酶解温度对蛋白质水解率的影响（略）
由图3可看出，50℃时EY3酶、EY4酶和EY5酶的蛋白质水解率都达到最高值，其中EY4酶的蛋白质水解率最高，EY3酶的蛋白质水解率最低。因此，选择50℃作为EY3酶、EY4酶和EY5酶降解罗非鱼片加工下脚料所得蛋白质水解率的最佳酶解温度。
2．3 同一反应条件不同的酶对蛋白质水解率的影响 选用不同的酶，分别为EY3酶，EY4酶，EY5酶，温度都是50℃，pH7，在液固比为3：1，加酶量为原料重万分之四的条件下，酶解8h，结果如图4所示。
由图4可看出，在温度50℃，时间8h，液固比3：1，加酶量为原料重万分之四的条件下，EY3酶、EY4酶、EY5酶的水解率逐渐增高，它们的水解率之间相差的幅度也较大，从低到高的顺序是：EY3酶＜EY4酶＜EY5酶。
图4 同一反应条件不同的酶对蛋白质水解率的影响（略）
2．4 同一反应条件不同的加酶方法对蛋白质水解率的影响 由以上实验可知，EY4酶和EY5酶对罗非鱼下脚料的水解效果较好。由于蛋白酶对肽键作用的专一性，采用单酶酶解时，只能从几个固定的氨基酸残基进行酶解，酶解程度受到限制。因此，采用多种酶复合酶解，以进一步提高水解率。
选用不同的加酶方法，在温度为50℃，pH7，液固比为3：1，加酶量为原料重万分之四的条件下，酶解6h：①空白对照；②使用单一的Ey5 酶；③先加Ey5酶（3h）后加（3h）Ey4酶；④先加Ey4酶（3h）后加（3h）Ey5 酶；⑤ Ey4酶和Ey5酶同时加。结果如图5所示。
图5 同一反应条件不同的加酶方法对蛋白质水解率的影响（略）
2.5 氨基酸组成分析 对罗非鱼下脚料水解液化蛋白中的氨基酸组成进行了检测，结果显示罗非鱼下脚料水解液化蛋白中共测出16种氨基酸（色氨酸未测），其中必需氨基酸7种，非必需氨基酸9种，氨基酸总量为5.03g/100g，必需氨基酸的量为1.56g/100g，占氨基酸总量的31.01%。非必需氨基酸的量为3.47g/100g，占氨基酸总量的68.99%。其中Asp(0.47%)、Glu(0.74%)、Ser(0.21%)、His(0.12%)、Gly(0.67%)、Thr(0.19%)、Arg(0.36%)、leu(0.33%)、Ala(0.42%)、Tyr(0.11%)、Val(0.20%)、Met(0.12%)、Phe(0.17%)、lie(0.16%)、lys(0.39%)、Pro(0.40%)。
鱼肉味道鲜美的程度主要由肌肉中鲜味氨基酸天门冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸的组成和含量来决定，其中天门冬氨酸、谷氨酸为呈鲜味、甘氨酸、丙氨酸为呈甘味的特征氨基酸。丝氨酸、脯氨酸也同甘味有关。罗非鱼下脚料水解液化蛋白中以上6种呈味氨基酸2.91g/100g，占氨基酸总量的57.85%，这些呈味氨基酸可赋于罗非鱼下脚料液化蛋白浓郁的海鲜风味。为水解液制作营养补充剂、海鲜调味品等提供理论依据。
3 讨论
3.1 挥发性盐基氮是水产品及肉与肉制品等鲜度程度的主要卫生评价标准。动物性食品由于酶和细菌的作用，在腐败过程中，使蛋白质分解而产生氨或胺类等碱性含氮物质，碱性含氮物质。参照黄鱼（黄花鱼）的挥发性盐基氮的卫生标准（GB2733-2004）小于或等于15mg/100g为一级鲜度，小于或等于35mg/100g为二级鲜度。
3.2 酶对作用底物有严格的专一性。酶作用于蛋白质，使蛋白质的三四结构被破坏，原来隐藏在分子内部的疏水性氨基酸如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等暴露在分子表面，当疏水性氨基酸位于肽链的非端基位置时，表现为苦味的最大值，这与选用酶制剂及可控制反应条件有关［8］。采用复合酶法，在温度50℃，pH7，酶解6h，可有效提取罗非鱼片加工下脚料中的蛋白质。
3.3 复合酶法用于罗非鱼下脚料制取液化蛋白，生产工艺简单、周期短。液化蛋白质营养丰富，含有大量的呈鲜氨基酸, 具有良好的开发价值和广阔的市场前景。
【参考文献】
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作者单位：海南大学海洋学院,海南 海口 570208.