点击显示 收起
【摘要】 目的 建立亮舒片中齐墩果酸的含量测定方法。 方法 在硅胶G薄层板上,以环己烷-丙酮-乙酸乙酯(5:2:1)为展开剂,采用双波长薄层扫描法测定,λS=530nm,λR=700nm。 结果 齐墩果酸点样量在0.25~3.0μg范围内线性关系良好,相关系数R=0.9970,回收率为99.55%,RSD小于5%。 结论 薄层扫描法测定舒片中齐墩果酸含量灵敏、简便、准确、易行,可用于该制剂的含量测定和质量控制。
【关键词】 亮舒片 齐墩果酸 薄层扫描法
Determination of oleanolic in Liangshu tablets by TLCS.
LUO Hai-yan, YU Chong-chong, MAO Yu.
(Hainan Medical College,Haikou 571101, Hainan, P. R. China; Zhongnan Nationality University, Chengdu 610072, Sichuan, P. R. China)
Abstract:Objective To establish a method for determination of oleanolic in Liangshu tablets by thin-layer scanning (TLCS). Methods The analysis was performed on silica gel G, with a developer of cyclohexane-acetone-ethylacetat(5:2:1),and spray reagent of 10% sulfuric acid-ethanol,the detection wavelength was λS=530nm,λR=700nm. Results A good linear relationship of oleanolic was obtained within the range of 0.25~3.0μg(r=0.9970),and the average recovery rates were 99.55% and RSD was 2.9%. Conclusion The methods is simple, accurate and reproducible.
Key words:Liangshu tablets; Oleanolic; TLCS
亮舒片为抗肝炎药,用于治疗病毒性迁延性慢性肝炎。其处方由女贞子等三味中药饮片组成,主要有效成分为齐墩果酸,为控制制剂质量,本文研究并建立其含量的TLCS测定法。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 仪器 CAMAG-3薄层扫描仪;NANOMAT-4手动点样仪;万分之一电子天平(沈阳龙腾电子称量仪器有限公司)。
1.1.2 试剂 均为分析纯。齐墩果酸对照品:批号110709-200304,中国药品生物制品检定所。
1.1.3 亮舒片由课题组自制。
1.2 方法 参阅《中国药典》和相关文献,筛选了TLCS层析条件、样品处理方法并进行了含量测定方法的方法学考察。
2 结果
2.1 层析相关条件的选择[1~3]
2.1.1 薄层板的确定 选择硅胶G板,并比较了手铺板、市售青岛海洋板与德国Merk板,结果以Merk板效果最好但价格昂贵,而手铺板不能达到分离度的要求,因此选用市售硅胶G薄层板。
2.1.2 展开条件的确定 比较了四种不同的展开系统,以待测斑点与相邻斑点的分离度作评价指标,选定环己烷-丙酮-乙酸乙酯(5:2:1)为展开剂,并以预吸附15min后再展开为佳。
2.1.3 温度与相对湿度的确定 比较了10℃以下与20℃的展开环境温度,结果表明展开应在10℃以下;还比较了不同的展开相对湿度(RH)32%、58%、65%、88%,以相对湿度58%左右为佳。
2.1.4 显色剂及显色方式的确定 经实验表明,25%磷钼酸乙醇溶液显色背景较深,而5%与10%的硫酸乙醇液显色效果相差不大,因此参考中国药典女贞子药材中测定齐墩果酸的方法,选取10%硫酸乙醇液为显色剂;而采用喷雾显色可能造成显色不均匀,因此采取浸板的方式;显色温度在90℃、100℃、105℃时差别不大,但显色时间有所不同,故选取100℃烘至斑点显色清晰。
2.2 测定波长的选择 取齐墩果酸对照品溶液(0.5mg/ml)1μl以及样品液各0.5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,展开,取出,晾干;浸于10%硫酸乙醇溶液中,取出,晾干,在100℃加热至斑点清晰,取出,在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板,周围用胶布固定,照薄层色谱法于波长530nm处进行扫描;选定样品色谱中与对照品相对应的斑点,分别进行光谱扫描,结果二者在530nm处均有最大吸收,在700nm处吸收最小。因此确定扫描波长为:λS=530nm,λR=700nm。
2.3 样品干扰性试验
2.3.1 对照品溶液的制备 精密称取齐墩果酸对照品适量,加无水乙醇制成0.5mg/ml溶液,作为对照品溶液。
2.3.2 样品供试品溶液的制备 本品10片,研细,取细粉约3g,精密称定,加乙醇50ml,加热回流20min,放冷,滤过,药渣加乙醇同上,重复回流一次,合并滤液,蒸干,残渣加无水乙醇微热使溶解,转移至10ml量瓶中,并加乙醇至刻度,摇匀,以0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液。
2.3.3 缺女贞子阴性供试品溶液的制备 按照处方量及工艺条件同法制成缺女贞子阴性样品,取其细粉约3g,精密称定,同供试品溶液制备项下制备,为缺女贞子阴性供试品溶液。在选定的条件下,同时取对照品溶液、样品供试品溶液、阴性供试品溶液进行薄层层析。结果表明,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,而阴性则无干扰。
图1 样品待测斑点、对照品斑点光谱扫描图(略)
图2 阴性样品、对照品、供试品TLC色谱图(略)
1、2 样品;3、4阴性样品;5、6齐墩果酸对照品
2.4 线性范围的考察 精密吸取齐墩果酸对照品溶液(0.5mg/ml)0.5μl、1μl、2μl、5μl、6μl点于同一薄层板上,层析,显色,扫描。记录色谱图,测定其吸光度积分值,并以吸光度积分值(A)对点样量(μg)进行回归,得标准曲线方程为:y=2175.7x+2077.3,r=0.9970。以吸光度积分值(A)对点样量(μg)作图,得一直线,结果表明点样量在0.25、0.5、1.0、2.5和3.0μg范围内,齐墩果酸点样量的吸光度积分值分别为2313.5、3359.9、4431.7、7520.3和8534.9,显示线性关系良好。见图3。
图3 齐墩果酸对照品标准曲线图(略)
2.5 供试品溶液制备方法的研究 女贞子为收载于《中国药典》2005年版一部31页的品种,参照药典进行实验,并根据此复方具体情况作调整。试验结果表明,供试品溶液色谱图中,齐墩果酸与相邻峰分离度大于1,峰形基本对称,与齐墩果酸对照品斑点Rf值一致,且阴性无干扰。见图4~6。
图4 样品供试液通道扫描图(略)
图5 齐墩果酸对照品通道扫描图(略)
图6 阴性样品通道扫描图(略)
2.5.1 回流提取法 取本品细粉约3g,精密称定,加乙醇50ml,加热回流30min,放冷,滤过,药渣加乙醇同上,重复回流1次,合并滤液,蒸干,残渣加无水乙醇微热使溶解,转移至10ml量瓶中,并加乙醇至刻度,摇匀,以0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液。
2.5.2 超声提取法 取样品粉末约3g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加乙醇50ml,超声处理2次,每次30min,其它同回流提取法操作。以选定的条件进行TLC法分析,试验结果表明,选用回流法制备的样品色谱中,齐墩果酸斑点明显深于(大于)超声法,因此选用回流提取法。
2.5.3 提取次数的确定 取本品细粉约3g,共3份,精密称定,加乙醇50ml,加热回流30min,分别提取1、2、3次,放冷,滤过,依次合并滤液,蒸干,残渣加无水乙醇微热使溶解,分别转移至10ml量瓶中,并加乙醇至刻度,摇匀,以0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液。结果表明,提取2次和3次, 齐墩果酸斑点大小和颜色相差不大,而均强于提取1次的,故确定本品提取2次。
2.5.4 提取时间的确定 取样品粉末3份,每份约3g,精密称定,加乙醇50ml,加热回流,依次分别提取10、20、30min,放冷,滤过,药渣加乙醇同上,重复回流一次,合并滤液,蒸干,残渣加无水乙醇微热使溶解,转移至10ml量瓶中,并加乙醇至刻度,摇匀,以0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液。试验结果表明,提取10、20、30min, 齐墩果酸斑点大小和颜色相差不大,从成分被提取完全和节约能源综合考虑,确定提取时间为20min。
2.6 精密度试验
2.6.1 重复性实验 精密吸取同一供试品溶液0.5μl,平行点6份于同一薄层板上,层析,显色,扫描,结果齐墩果酸吸光度积分值分别为2548.9、2768.0、2658.6、2658.8、2609.8和2689.3,相对标准差(RSD)<5%,表明方法重复性良好。
2.6.2 异板精密度实验 精密吸取同一供试品溶液0.5μl,平行点6份于同一薄层板上,层析,显色,扫描;用另一薄层板重复操作,结果测得齐墩果酸吸光度积分值(n=12)的相对标准差(RSD)<5%,表明方法精密度良好。见表1。
表1 异板精密度试验结果(略)
2.7 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液0.5μl,平行点6份于同一薄层板上,薄层层析,显色后,同样大小的玻璃板覆盖,周围用胶布固定,遮光保存,并分别于0、0.5、1、2、3、4h扫描,测得样品中齐墩果酸吸光度积分平均值分别为2394.60、2382.24、2597.26、2619.28、2600.86、2618.14,相对标准差(RSD)<5%,表明样品供试液层析显色后,遮光保存在4h内稳定。
2.8 加样回收率试验 已知含量的样品粉末9份,精密称定,加入齐墩果酸对照品,加乙醇50ml,加热回流20min,放冷,滤过,药渣加乙醇同上,重复回流1次,合并滤液,蒸干,残渣加无水乙醇微热使溶解,转移至2ml量瓶中,并加乙醇至刻度,摇匀,以0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液。精密吸取供试品溶液0.5μl及对照品溶液0.5μl和3μl,点于同一薄层板上,按下式计算回收率,结果见表2。
回收率(%)=测得齐墩果酸的量(mg)-制剂中齐墩果酸的量(mg) 加入齐墩果酸对照品量(mg)×100%
表2 加样回收率试验结果(略)
回收率试验结果表明,9次试验的加样回收率均在95%~105%之间,平均值为99.55%,RSD小于5%,说明该方法的回收率良好。
2.9 样品含量测定 取三批中试样品(批号1、2、3), 照拟定的方法,制备样品供试液。精密吸取供试品溶液0.5μl,对照品液1μl和3μl,交叉点于同一硅胶G薄层板上,层析、显色、扫描,测得吸光度积分值,计算含量,结果分别为8.61、8.95和9.77mg/g。由含量测定结果,结合大生产实际情况,暂定本品以干燥品计每片含齐墩果酸(C30H48O3) 应为1.8mg。
2.10 药材含量测定 照《中国药典》2005年版一部31页女贞子(含量测定)项下方法,取药材三批样品细粉约1g,精密称定,加乙醇50ml,加热回流20min,放冷,滤过,药渣加乙醇同上,重复回流一次,合并滤液,蒸干,残渣加无水乙醇微热使溶解,转移至10ml量瓶中,并加乙醇至刻度,摇匀,作为供试品溶液。以拟定的条件进行层析、显色、扫描,测得吸光度积分值,计算含量,结果其三批样品测定结果分别为15.40、16.52和14.69mg/g。
3 讨论
实验发现,采用10%硫酸乙醇溶液作为显色剂时,喷雾务必均匀,使薄层板均匀湿润,否则对结果影响较大;若采用浸板的方法可使显色均匀而测定结果稳定。
【参考文献】
[1] 中国药典(一部).2005,31.
[2] 王新功,吕华瑛,李箐.不同蒸制时间对女贞子中齐墩果酸含量的影响[J].山东医药工业,2002,21(4):53~54.
[3] 杜瑜,李焕德. 齐墩果酸的研究进展[J].中国药房,2006,17(4):304.
作者单位:海南医学院,海南 海口 571101;成都中医药大学,四川 成都 610072; 西南民族大学,四川 成都 610072.