HEV-GST 融合蛋白的表达、纯化及鉴定

【摘要】  　　目的 利用谷胱苷肽转移酶（GST）蛋白纯化系统表达、纯化和鉴定HEV-GST融合蛋白。 方法 将标记有GST的重组大肠杆菌E.coli BL21诱导表达HEV-GST融合蛋白，采用GST蛋白纯化系统进行纯化、所得产物进行SDS-PAGE和Western Blot鉴定。 结果 大肠杆菌细胞高效表达出约43Kd蛋白，其分子量与HEV-GST分子量相符，经Western Blot显示所纯化蛋白能被抗GST抗体识别。 结论 GST大肠杆菌表达系统中高效表达的HEV-GST融合蛋白可用于临床及实验研究。

【关键词】  戊型肝炎病毒（HEV） 融合蛋白 谷胱甘肽转移酶（GST） Western Ｂlot

　　Expression and identification of recombinant HEV-GST fusion protein.

　　LI Zhen-hua， XIAO Gui-chu， LU Xue-dong.

　　（Department of Clinical Laboratory, Affiliated Futian Hospital of Guangdong Medical College,Shenzhen Fourth Municipal People’s Hospital, Shenzhen 518033, Guangdong, P.R. China）

　　Abstract：Objective  To express and identify recombinant HEV-GST fusion protein using GST protein purifying system.  Methods  The recombinant HEV-GST protein was expressed in E.coli cells and the products were purified by GST purifying system. The specific expression was identified by SDS-PAGE and Western blot.  Results  The HEV-GST fusion protein was highly expressed on 10% SDS-PAGE with molecular weight of 43kD and the fusion protein was identified by anti-HEV antibody on PVDF membrance.  Conclusion  The recombinant HEV-GST fusion protein is expressed in E.coli cells efficiently, and the purified HEV-GST can be used in clinical and experimental investgations.

　　Key words：HEV;  Fusion protein;  GST;  Protein purifying system; SDS-PAGE;  Western blot

　　戊型肝炎（戊肝）是一种由戊型肝炎病毒（HEV）引起的经肠道感染的急性肝炎。主要见于成人（15～40岁），为一种自限性疾病，潜伏期为2～9wk，多数病例起病急，约3%转变为爆发性肝炎而死亡，而孕妇感染死亡率可高达20%。目前尚未发现慢性感染。其临床病程特征主要是黄疸、肝肿大和转氨酶升高到参考范围上限的20倍。HEV结构和生化特性属环状病毒，基因组为单股正链RNA，长约7.5kb。其基因组含三个开放读码框架（ORF1、ORF2、ORF3），其中ORF1编码非结构蛋白如依赖RNA的RNA多聚酶和螺旋酶等一些与病毒复制有关的蛋白质； ORF3编码功能未知的小分子蛋白，部分与ORF2重叠，但显示不同的阅读框架；ORF2编码一含660个氨基酸的多肽（pORF2），为病毒衣壳蛋白，ORF2存在多个重要免疫表位及一富含碱性氨基酸残基的多肽［1～3］。由于戊肝病毒尚不能进行有效的体外组织培养，传统的减毒疫苗和灭活疫苗的研制无法进行，因此HEV基因工程疫苗的研制主要集中在ORF2基因［4］。本实验探讨HEV ORF2重组蛋白的表达、纯化和应用。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料  重组大肠杆菌E.coli BL21、LB培养液、氨苄西林（Amp）、异丙基硫代-β-D-半乳糖甙（IPTG）、十二烷基硫酸钠（SDS）、聚丙烯酰胺（PAGE）均为Sigma产品。

　　1.2  仪器  包括CO2培养箱和摇床、Eppendorf台式离心机、北京六一仪器厂双垂直电泳系统、BD Biosience 蛋白纯化系统、TY-80B脱色摇床、贝克曼高速冷冻离心机、Eppendorf BioPhotometer分光光度计。

　　1.3  重组蛋白表达  挑单一菌落转种于1.0ml LB培养液（Amp的终浓度为100mg/L），37℃摇床培养过夜，用新鲜LB培养液作100倍稀释过夜培养物，37℃摇床培养3h，光密度（OD600nm）值约1.0时加诱导剂IPTG（终浓度为1mmol/L）诱导表达4h，收获工程菌。4℃离心（10000rpm，20min），弃上清，取菌体沉淀备用。

　　1.4  重组蛋白的分离  将收获的工程菌转移到研钵中，加2.5倍矾土（如500mg细胞:2.5g矾土）进行研磨，直到混合物变成糊状，加萃取液（每100mg加萃取液2ml）混匀后将其装入干净的聚丙烯离心管中，10 000rpm，离心20min，取上清液转入另一支干净的管中保存，此为含重组蛋白的样品。

　　1.5  SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）  取10μl以上所获得产品和2倍样品浓缩液（10%SDS、0.5M Tris pH7.0、甘油、水、1%溴酚兰，5%巯基乙醇）按1:1混合，煮沸5min，10 000rpm离心5min，取其上清液作为电泳样品，以低分子量标准蛋白做对照，按Hamer方法制备10% SDS-PAGE凝胶，上样后100V恒压电泳约60min。电泳完毕，将凝胶放入染色剂（0.1%考马斯亮兰R250,水:甲醇:冰醋酸=5:5:2）中染色30min，最后用脱色液（异丙醇12.5%，冰醋酸10%，用蒸馏水稀释）显示电泳图谱。确定有特定重组蛋白表达后再进行下一步的纯化。

　　1.6  重组蛋白纯化  用BD Biosience GST蛋白纯化系统将以上样品纯化，用蛋白核酸仪监控洗脱状态，并收集洗脱液。

　　1.7  重组蛋白的鉴定

　　1.7.1  SDS-PAGE电泳  将收集到的洗脱液与低分子量标准蛋白进行SDS-PAGE电泳。用双垂直电泳系统一次电泳两块凝胶，电泳完毕后，取下一块凝胶进行染色显示电泳图谱。

　　1.7.2  电泳转移  取下另一块凝胶（不经过染色）和转印滤纸、PVDF转印膜放入转印缓冲溶液（10%转移缓冲液、20%甲醇）中浸泡片段，放入转移槽中，180mA恒流60mins,将重组蛋白从凝胶转印至PVDF转印膜上，完成后将转印膜用洗涤液（pH7.4 含5%Tween-20的PBS）浸泡片刻，取出用滤纸压干。

　　1.7.3  免疫印迹  将PVDF膜放入反应槽中，以未加纯化产品的PVDF膜为阴性对照，分别加印迹缓冲溶液（pH7.4含5%Tween-20的PBS加5%脱脂奶粉）封闭5mins后加鼠抗GST单克隆抗体，反应槽置摇床上室温反应1h，用洗涤液漂洗3次，加HRP标记的羊抗鼠IgG抗体（1：5000稀释）反应1h，用洗涤液漂洗3次后加底物显色10mins，用水冲洗终止反应，观察显色结果。

　　2  结果

　　2.1  GST重组菌诱导表达的结果  从电泳图谱1可以看出，GST重组菌在LB培养皿中分离出单菌落后经增菌经诱导后其表达产物中含有与标准菌相同的蛋白，初步证明培养物为含HEV-GST的重组菌。

　　图1  标准菌，未经诱导的重组菌，GST重组菌电泳图（略）

　　1和10为低分子量标准蛋白；2和6为未经诱导的重组菌；3、4、5和7、8、9为经诱导而未纯化的重组菌

　　2.2  GST重组菌纯化的结果  从SDS-PAGE电泳图谱图2可以看出，未经诱导的重组菌并无蛋白表达，而经诱导但未纯化的产品则含多种分子量大小不同的蛋白，且各蛋白组分含量不同。经GST蛋白纯化系统纯化的产品则成分单一，与抗GST抗体特异性结合， 只在43kD处有表达。

　　2.3  HEV-GST重组蛋免的疫印迹结果  用纯化产品（分子量为43KD）样品1份，与阴性对照样品3份和标准蛋白样品1份，经免疫印迹后，结果纯化产品在43KD处有显色带，阴性对照样品均无显色带出现，标准蛋白样品在97.7、66.2、43、31、20和14.4KD处均有显色带。

　　3  讨论

　　GST基因融合表达系统广泛用于各种融合蛋白的表达，它包含一系列的表达载体，可以在大肠杆菌和酵母菌等宿主细胞中表达GST融合蛋白，其表达蛋白质带有GST头部，可利用含有还原型谷胱甘肽的纯化柱进行纯化，得到单纯的融合蛋白，去除背景蛋白的干扰。同时GST基因融合表达系统还具有剪切功能，可将GST头部切除，得到单一的目的蛋白，进行相关功能的研究［5］。谷胱甘肽树脂可高效地亲和GST标记的重组蛋白，与GST标志的蛋白质牢固结合，使该蛋白从多成分的细胞萃取物中分离出来，从而得到高纯度HEV-GST特定蛋白。

　　图2  纯化后的HEV-GST重组蛋白电泳图（略）
　　
　　从左到右：1为低分子量标准蛋白；2为未纯化的菌体萃取液；3纯化后的产品（以1为对照，其分子量为43kd）
   
　　应用GST蛋白纯化系统时，由于GST是一种大分子蛋白质，比其他小分子标记物更易被蛋白酶水解而变性，所以在利用GST-蛋白纯化系统纯化蛋白时应尽可能快地进行，以减少标本的损失。每一种重组菌都有其生长和表达规律，考察其诱导最佳OD值以及诱导的持续时间可以了解外源蛋白在菌体中的表达与积累情况，据此可以判断最适的诱导时间以及菌体收获时间，因为诱导过晚，菌体老化，其生长与外源蛋白的表达会下降，特别是诱导过晚时大量的能量会消耗在外源蛋白上而使菌体提前进入衰亡期；收获太慢时菌体会出现自溶。据文献报导，HEV-GST重组菌在OD600nm为1.0时诱导比较合理，最佳诱导时间为4h，诱导剂IPTG最佳浓度为1mmol/ml，此时菌体蛋白达到最大值，为最适收获时期［4］。本实验在LB培养基中加入Amp是依据插入失活原理。由于目的基因插入位点在抗四环素基因上，宿主细胞失去对四环素的抗性，利用加Amp的培养基可筛选出含重组质粒的细菌。免疫印迹技术因结合了凝胶电泳分辨率高和固相免疫测定特异敏感以及可从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别的特点。因此利用GST蛋白纯化系统对HEV-GST重组蛋白进行纯化及鉴定，所得纯化蛋白可用于进一步的实验研究。

【参考文献】
  　　［1］ 赵宇军，赵立平，刘丽,等.戊型肝炎病毒分子生物学及疫苗研究进展［J］. 畜牧兽医科技信息，2004,1：12～15.

　　［2］ 马雁冰，孙茂盛，李鸿钧，等.戊型肝炎病毒ORF2 C端抗原片段的表达及其免疫学特性研究［J］. 中华微生物学和免疫学杂志，2000，（5）：419～422.

　　［3］ 陈浩，陈于红，朱德煦,等.重组蛋白质纯化技术［J］.中国生物工程杂志，2002，22（5）：87～92.

　　［4］ 郭岩，王玉梅，张桂英,等.HEV ORF2 重组菌菌种的稳定性及融合蛋白的应用［J］.微生物学杂志，2002，22（5）：35～36.

　　［5］ Wu X,Oppermann U.Higlrlevel expression and rapid purigication of rare-codon gene fusion system［J］.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2003,786（1-2）:177～185.

作者单位：广东医学院附属福田人民医院（深圳市第四人民医院）检验医学部，广东 深圳 518033.