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【摘要】 目的 建立一种快速、准确测定血液中长春新碱含量的测定方法。 方法 在酸性条件下长春新碱与高锰酸钾产生化学发光的行为,对影响化学发光强度的因素进行了实验和探讨,罗丹明6G能显著增强体系的发光强度。 结果 线性范围为1.21×10-7mol·L-1~1.21×10-5mol·L-1; RSD为1.28%(n=12);检测限为4.8×10-8mol·L-1。该体系已经应用于血样中长春新碱含量的测定,结果令人满意。此外,在酸性高锰酸钾-长春新碱化学发光体系光谱学研究的基础上,探讨了该体系的化学发光反应机理。 结论 该方法处理简单,操作简便,便于快速、准确的检测。
【关键词】 长春新碱 化学发光 高锰酸钾 含量测定
长春新碱(Vincristine)是以长春碱(长春花中生物碱含量最高的一种,分子式见图1)为原料合成的医疗用药。作为一种常见抗肿瘤药,临床上用于治疗白血病、肿瘤和癌症等疾病。Jin[1]等利用毛细管区带电泳和电化学方法结合测定了人体红血球细胞中硫酸长春新碱的动力吸收情况。迄今报道的测定硫酸长春新碱的方法有液相色谱法、免疫法、电分析法、伏安法、毛细管电泳、紫外分光光度法,中国药典[2]规定硫酸长春新碱注射液用高效液相色谱法。本文用化学发光法[3]直接测定血样中长春新碱。
图1 长春新碱的分子结构(略)
Fig 1 Molecular structure of Vincristine
1 实验部分
1.1 仪器和试剂 长春新碱(Vincristine,中国药品生物制品检定所);IFFM-D型流动注射分析仪 (西安瑞科电子科技有限公司);IFFS-A型多功能化学发光检测器 (西安瑞迈电子科技有限公司);Lambda 800 UV/Vis spectrometer (Perkin Elmer Instruments); Eclipse荧光光谱仪(美国VARIAN公司);乙醇 (分析纯,上海试剂总厂);实验用水均为二次蒸馏水。本实验采用静态注射法测定化学发光:分别移取0.4ml高锰酸钾和硫酸溶液于反应池(10ml烧杯)中,混合均匀后置于测量室中光窗上方,盖上测量室的上盖,打开光门,用微量进样器注入10μl样品乙醇溶液(或无水乙醇,作为空白测定),记录化学发光动力学曲线,以峰高定量。其中,高锰酸钾为氧化剂。
1.2 样品制备 准确吸取2.0ml的血清样品,加2.0ml HClO4(6%,v/v),混合均匀,然后以3 000r·min-1离心10min去蛋白,吸取离心以后的血样1.0ml,用二次蒸馏水定容至50ml待测定。
2 结果和讨论
2.1 实验条件的优化 对影响化学发光强度的因素:氧化剂、反应介质及其浓度、表面活性剂等进行实验;结果表明:反应介质硫酸的浓度为1.25mol·L-1(如图2),氧化剂KMnO4的浓度为1.0×10-4mol·L-1时发光强度最大。同时考察荧光试剂罗丹明6G、罗丹明B[4]、硫酸喹啉等对发光信号的影响,结果罗丹明6G使发光信号增加最多,且当其浓度为3.0×10-7mol·L-1时发光强度最大(如图2)。
图2 硫酸浓度对发光强度的影响(略)
Fig 2 Effect of sulphuric acid concentration
2.2 工作曲线、检测限和精密度 在选定的最佳条件下对不同浓度的长春新碱进行测定,测得的发光值与浓度在1.21×10-7mol·L-1~1.21×10-5mol·L-1范围内成良好的线性关系,回归方程为I=38115702C+38.769,R2=0.9985(C的单位为mol·L-1),检测限为4.8×10-8mol·L-1;对浓度为1.47×10-6mol·L-1的长春新碱平行测定,其相对标准偏差为1.28%。
2.3 干扰实验 对于1.47×10-6mol·L-1的长春新碱溶液,5 000倍量的Na+、K+ 、Cl-;500倍的Ca2+、Fe3+、Cu2+、Mg2+;200倍的尿素、NO3-;100倍的糊精、葡萄糖等不干扰测定。
图3 罗丹明6G浓度对发光强度的影响(略)
Fig 3 Effect of rhodamine 6G concentration
2.4 血样样品的测定 取一定处理后血样用二次蒸馏水稀释适当倍数后进行加标回收试验,同时以不加长春新碱的血样作空白对照,结果如表1所示。从中可以看出,血样中长春新碱的回收率结果比较令人满意,因此本法可以用于生物样品中长春新碱的测定。
表1 血样中长春新碱的回收实验(略)
Table 1 Recoveries of Vincristine
2.5 反应机理的初步探讨 研究了长春新碱在KMnO4-H2SO4体系中的化学发光光谱、紫外可见吸收光谱和荧光光谱。化学发光光谱实验发现最强发光波长为680nm;紫外可见光谱实验发现随着加入的高锰酸钾浓度增大,长春新碱的吸收峰逐渐减小直至消失,同时未出现新的吸收峰,说明长春新碱被高锰酸钾氧化;由于在高锰酸钾酸性体系中的最大发光波长为680nm, 与其荧光波长不同,表明长春新碱及其氧化产物都不是其化学发光体系中的发光体,因此我们推测在长春新碱-KMnO4-H2SO4发光体系中的发光体是高锰酸钾的还原产物-激发态的Mn(Ⅱ)[5],其发光反应过程如图4所示。
MnO4-H+ alkaloidMn(Ⅱ)*Mn(Ⅱ)*Mn(Ⅱ)+hυ(680nm)
图4 Mn(Ⅱ)发光反应过程(略)
Fig 4 Proposed mechanism for the chemiluminescence of alkaloid-KMnO4-H2SO4
【参考文献】
[1] 中华人民共和国医药管理局科技教育司组织.药物化学[M].北京:中国医药科技出版社,1996,50.
[2] 中华人民共和国卫生部药典委员.中华人民共和国药典(二部)[S]. 北京:化学工业出版社,2000, 659.
[3] 肖丽梅. 化学发光法检测前列腺特异性抗原对前列腺癌的诊断价值分析[J].安徽医药, 2006,(04):
[4] 吴明星. 高锰酸钾-维生素C-罗丹明B化学发光体系的研究[J].安徽医药, 2003,(02):135.
[5] BenjaminJ.Hindson, Neil W.Barnett. Analytical applications of acidic potassium permanganate as a chemiluminescence reagent. Anal. Chim. Acta, 2001, 445:1~19.
作者单位:湄洲湾职业技术学院化学工程系, 福建 莆田 351254.