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首页医源资料库在线期刊中国热带医学杂志2007年第7卷第8期

人体血清中邻苯二甲酸酯类化合物含量分析

来源:中国热带医学
摘要:【摘要】目的建立液相色谱-串联质谱联用同时测定血清中5种环境内分泌干扰物邻苯二甲酸酯类(PAEs)残留的方法。方法样品经提取净化后,采用高效液相色谱-串联质谱联用法测定其中邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)、邻苯二甲酸二正辛......

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【摘要】    目的 建立液相色谱-串联质谱联用同时测定血清中5种环境内分泌干扰物邻苯二甲酸酯类(PAEs)残留的方法。 方法 样品经提取净化后,采用高效液相色谱-串联质谱联用法测定其中邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)、邻苯二甲酸二正辛酯(DOP),及血清中有关激素水平,并运用SPSS分析软件中的非参数统计方法对测定结果进行相关性分析。 结果 5种PAEs均在血清中检出,含量范围在ND~40.02mg/L,Spearman相关分析显示,女性血清中DBP与E2呈正相关(r=0.410),DEP与T呈负相关(r=-0.588),男性DEP与PRL呈正相关(r=0.839)。 结论 邻苯二甲酸酯类物质普遍存在于人体中,血清中邻苯二甲酸酯类环境激素的污染比较严重,应引起有关部门的重视。

【关键词】  邻苯二甲酸酯 高效液相色谱-串联质谱 血清分析 激素

  邻苯二甲酸酯(别名酞酸酯, Phthalates ,Phthalic Acid Esters,简称PAEs)是一种普遍使用的化学物质,用作增大塑料产品的可塑性和提高产品的强度,也用于农药载体、驱虫剂、化妆品、香味品、润滑剂和去泡剂的生产原料[1]。但近年来的研究结果表明环境中微量PAEs可产生多种扰乱动物内分泌的生化和整体效应,损害生殖和发育,因此将PAEs归入内分泌扰乱化学品中的环境雌激素[2]。2004年欧盟立法在所有玩具和儿童用品中禁止使用PAEs[3]。目前国内外关于酞酸酯的研究主要集中在环境中的分布[4],对于酞酸酯在人体中的污染情况则由于样品基底复杂而研究较少。目前测定这些环境雌激素的方法也主要以高效液相色谱法为主,而较少见用液质联用测定法的报道。本文以美国环保局(EPA)列为优先控制的邻苯二甲酸二甲酯(Di-methl phthalate,DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(Di-ethyl phthalate,DEP)、邻苯二甲酸二丁酯(Di-n-butyl phthalate,DBP)、邻苯二甲酸二异辛酯(Di(2-ethlhexyl)phthalate,DEHP)和邻苯二甲酸二正辛酯(Di-n-octyl phthalate,DOP)等 5种酞酸酯作为研究对象,建立了高效液相色谱-串联质谱联用法测定血清中酞酸酯的方法,以了解酞酸酯在人体中污染现状。

  1  材料与方法

  1.1  主要仪器与试剂  API 3000串联三级四极杆质谱仪(美国应用生物系统公司),配有Turbo-Ionspray源、针泵以及Analyst 1.4数据处理系统,气源为高纯氮气;Agilent 1100 液相色谱仪(美国Agilent公司);色谱柱: Pinnacle Ⅱ C18,2.1mm×150mm×5.0μm(美国Restek公司)。Allegra 64R 高速冷冻离心机(美国Beckman Coulter公司);N-EBAPTM112氮气吹扫仪;Milli Q plus纯水系统(美国Millipore公司);0.45μm有机系针筒式微孔滤膜过滤器。DMP、DEP、DBP、DEHP、DOP标准品,纯度>99%,购自美国Sigma公司;甲醇、正己烷均为色谱纯(Merck);实验用水为二次蒸馏超纯水。测定各种激素的ELISA试剂盒购自德国宝灵曼公司。

  1.2  LC/MS/MS分析条件  液相色谱条件:流动相为甲醇-水(95+5,V/V),含0.1%的甲酸;流速0.15ml/min;柱温25℃;进样体积:20μl。质谱条件:离子源为ESI(+),检测方式为多反应监测(Multiple Reaction Monitor, MRM)方式,利用保留时间和碎片信号比值判断定性结果,每个待测成份分别选定一个定量离子对和一个定性离子对。质谱条件具体如下:IS电压:5000V;离子源温度:500℃;雾化气压力:11psi;气帘气压力:11 psi;CAD=5L/min;Gas1=11L/min;Gas2=70L/min;MRM参数见表1。

  1.3  样品收集及处理  血清样品来自于北京大学深圳医院胸外整形科进行美容整形的住院病人,经体检筛查无其他疾病的健康人群,包括男性10名,女性46名,年龄在14~53岁。

  1.3.1  血清预处理  取1ml血清,加入5ml正己烷,漩涡振荡10min后,4 000r/min离心5min,吸取上层正己烷层,用氮气吹至近干,立即加入甲醇饱和的正己烷0.1ml,混匀后过0.45μm有机系微孔滤膜后进样,LC/MS/MS测定。

  1.3.2  血清激素测定  使用试剂盒采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定血清中黄体生成素(Luteinizinghormone,LH),卵泡刺激素(Folliclestimulatinghormone,FSH),催乳素(Prolactin,PRL),孕酮(Progesterone,P),睾酮(testosteone,T),雌二醇(estradiol,E2)。

  1.4  空白实验  由于PAEs污染较普遍,实验时尽量避免使用塑料容器,同时对实验中用到的试剂、玻璃比色管、离心管、微孔滤膜等所有实验所需试剂器械等做空白实验以排除实验过程可能出现的污染。保证所用试剂及器械不会污染样品而影响分析结果。

  表1  邻苯二甲酸脂MRM参数表(略)

  *标记为定量离子对

  1.5  标准曲线的绘制  精确称取5种PAEs标准品各0.1000g,于5个100ml容量瓶中,各加入1ml正己烷助溶,再用甲醇定容至100ml,得浓度为1.0g/L的标准储备液;取5种储备液各0.5ml于50ml容量瓶中,甲醇定容至50ml,得10.0mg/L混合标准中间液;以上标液于-20℃冰箱中保存可用6个月。临用时将中间液用甲醇分别稀释成浓度为0.1、0.5、1.0、5.0、10.0μg/L的混合标准系列溶液,进样20μL测定。以各PAEs浓度为横坐标,相应定量离子对MRM峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。

  2  结果

  2.1  标准曲线及检出限  5种PAEs在0.1~10.0μg/L范围线性良好,相关系数在0.9969~0.9999之间。以3倍信噪比(S/N)计算5种PAEs的最低检出限,见表2。

  表2  标准曲线相关系数及检出限(略)

  2.2  检测结果

  2.2.1  血清样品的检测结果 在避免污染的前提下,测得人体血清中的PAEs含量水平及有关激素水平。见表3、4。

  表3  女性血清中5种PAEs含量及相关激素含量(略)

  注:ND 未检出,下同

  表4  男性血清中5种PAEs含量及相关激素含量(略)

  从测定结果来看,人体血清样品中均检出PAEs,血清中含量范围为ND~40.02mg/L,平均4.62mg/L,血清含量DEHP >DBP>DEP >DOP>DMP。男性血清中PAEs含量高于女性。

  2.3  统计学分析  血清中PAEs和激素水平呈非正态性分布,采用非参数相关性分析,用SPSS10.0软件中的Spearman相关分析对以上数据进行相关性分析。结果表明,女性血清中DBP与E2呈正相关(r=0.410),DEP与T呈负相关(r=-0.588),男性DEP与PRL呈正相关(r=0.839)。而血清中的PAEs与LH和FSH等垂体分泌的激素水平间相关关系不显著(P>0.05)。结果见表5~6。

  3  讨论

  过去一直认为邻苯二甲酸酯(PAEs)的毒性低,因而毫无限制地生产和使用,世界上目前PAEs的年产量至少在200万吨以上,我国邻苯二甲酸酯类产量占总产量的70%以上,由于该化合物生产成本较低,是塑料工业中广泛使用的增塑剂,但在使塑料软化的同时,会逐渐从塑料中释放出来,进入环境和生物体内,对环境和生物体造成潜在危害。PAEs在环境中残留期较长,生物对PAEs有较强的富集作用。流行病学研究表明过去几十年来男性精子数量持续减少、生育能力下降与吸收越来越多的邻苯二甲酸酯有关,此外,男性睾丸癌和生殖器官发育不良也与这种化学物质有关。该类化合物造成的污染目前已受到有关政府和国际机构的关注。

  表5  女性血清中5种PAEs含量及激素水平范围相关性分析结果(略)

  表6  男性血清中5种PAEs含量及激素水平范围相关性分析结果(略)

  注: P<0.05, P<0.01。
   
  本研究选取部分健康人群的血清样品进行测定,由测定结果可以看出,人体血清普遍受到PAEs污染,含量水平在ND~40.02mg/L,平均4.62mg/L。从测定的平均值来看,人体血清样品暴露量为DEHP>DBP>DEP>DOP>DMP,男性高于女性。不同PAEs含量的差异可能与PAEs在生产和生活中的产量和使用量的不同有关。在我国,PAEs产量占增塑剂总产量的80%,其中DEHP是最常使用的一种,约占增塑剂总量的45%,其次为DBP,而DOP、DEP、DMP的使用则较前两者为少。不同性别人群血清中PAEs含量的不同可能与男女社会活动的差异有关。作为一种环境内分泌干扰物,PAEs在动物试验中显示的生殖和发育毒性作用被认为可能与其对内分泌系统的干扰作用有关,而且动物试验中也发现了染毒动物睾酮水平的下降[5]。本次研究在测定血清PAEs含量水平的同时,还采用ELISA法测定了人血清样品中的激素水平,试图探讨两者间的相关关系,由本次人血清样品的测定结果和Spearman相关性分析可以看出,女性血清中仅DBP含量与E2呈正相关关系,DEP与T呈负相关,相关系数分别为0.410和-0.588,且仅呈弱相关关系;男性血清中仅DEP含量与PRL呈显著正相关关系,相关系数为0.839,其他PAEs与激素水平之间并无显著相关性(P>0.05),而且5种PAEs与各种激素水平间的相关关系并不均衡,相关系数或正或负,没有趋势可循,由于PAEs在体内具有迅速代谢的生物特性,因此血清中PAEs含量水平只能表示现在的暴露水平,不能显示过去的暴露状况,而血清中的激素水平是既往暴露累积的结果,因此,仅根据一次横断面的测定结果,是无法得出准确结论的,尚需要一个长时间的、设计周密的时间序列研究来确证。

【参考文献】
    [1] Meek MD,Clemons J,Wu ZF,et al. In vitro and in vivo assessments of the alleged estrogen receptor-mediated activities of phthalate esters[J]. Toxicologist,1997,36(3):295~297.

  [2] Hanson DK,Granfton TF. Evaluation of di(2-ethylhexyl) phthalate-induced embryotoxicity in rodent whole-embryo culture[J]. J Toxicol Environ Health,1994,43(3):361~362.

  [3] Erin E. Dooley. 欧盟禁止在玩具中使用邻苯二甲酸酯[J].Envieronmental Health Perspectives,2005,113A:25.

  [4] 林兴桃,王小逸,任仁.环境内分泌干扰物—邻苯二甲酸酯的研究[J].环境污染与防治,2003,25(5):286~287.

  [5] Ema M, Miyawaki E, Kawashima K. Critical period for adverse effects on development of reproductive system in male offspring of rats given Di-n-butyl phthalates during late pregnancy[J]. Toxicol Lett, 2000,111:271~278.


作者单位:北京大学深圳医院胸外科,广东 深圳 518036; 深圳市疾病预防控制中心,广东 深圳 518000; 深圳市宝安区观澜卫生监督所,广东 深圳 518000.

作者: 黄晓群,刘红河,王晖 2010-1-13
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